天麻蜜环菌深层发酵生产工艺研究

李进进 邓愍民 杨明

（江西国药有限责任公司 南昌 330052）

天麻蜜环菌（Armillaria Mellea）是与著名中药天麻（Gastrodia Elata Bl.）共生的食药两用的美味食用菌，其增养物营养丰富，具有与天麻相似的药理作用和临床疗效。现代研究表明，蜜环菌中主要含有萜类、甾醇类、多糖、腺苷类和氨基酸类等化学成分，具有镇静、降血压、降血糖、催眠、抑菌、防癌、抗氧化、抗衰老、抗惊厥、抗肿瘤、抗辐射、免疫调节等广泛的生物活性[1～4]，被广泛应用于开发保健食品、功能性食品及药品中。本研究旨在通过正交设计优化天麻蜜环菌的深层发酵工艺条件，建立天麻蜜环菌深层发酵的生产工艺，解决野生资源量受限制的问题。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 天麻蜜环菌，由江西国药有限责任公司提供。

1.1.2 仪器设备 AUTO T4 全自动细胞计数仪（美国Nexcelom 公司）；TS-100C 恒温摇床（杭州同祺仪器有限公司）；DHG-9036A 恒温鼓风干燥箱（上海万锐实验室设备有限公司）；YG-1.2 型脉动真空灭菌柜（江苏神农灭菌设备有限公司）；15 L、50 L 全自动机械搅拌发酵罐（上海国强生化工程装备有限公司）；高速冷冻离心机（广州沪瑞明仪器有限公司）；BX43 生物显微镜（奥林巴斯公司）；BT25S 赛多利斯电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.1.3 原料及试剂 麸皮、豆粕、玉米粉（五大连池市可信生物技术有限公司）；葡萄糖（山东祥瑞药业有限公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4）、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、蔗糖（国药集团化学试剂有限公司）；琼脂、维生素B1（VB1，赛国生物科技有限责任公司）；蛋白胨、酵母膏（梁山科泰生物制品有限公司）。

1.1.4 培养基 斜面培养基：麸皮50 g/L，琼脂20 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，水适量，pH 自然。种子培养基：玉米粉40 g/L，豆粕20 g/L，葡萄糖10 g/L，蔗糖20 g/L，酵母膏3g/L，VB10.03 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，豆油4 ml/L，水适量，pH 自然。发酵培养基：玉米粉20 g/L，豆粕10 g/L，葡萄糖10 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，豆油2 ml/L，水适量，pH 自然。

1.2 检测方法 含菌量测定：用移液枪移取10 μl充分混匀含有菌丝体的发酵液，加入计数板的加料仓，将计数板插入细胞计数仪的样品槽，按下计数仪上的计数细胞按钮，待数据稳定后，记录含菌量。重复测3 次，取其平均值作为实测含菌量。

1.3 实验方法

1.3.1 斜面活化培养 取天麻蜜环菌斜面保藏菌种划线接种于活化斜面，置于恒温培养箱中温度（25±1）℃、湿度70%～85%，恒温静置培养15 d。

1.3.2 15 L 发酵罐（种子罐）培养 按照10%（体积分数）的接种量接种于15 L 发酵罐，温度（25±1）℃，转速100 r/min，溶解氧为5.0～7.0 mg/L，培养6～7 d，每天取样测定含菌量。

1.3.3 50 L 发酵罐（发酵罐）培养 在50 L 发酵罐中进行深层发酵工艺研究，通过单因素试验，分别考察溶解氧、昼夜温差、发酵时间和接种量对含菌量积累的影响。

2 结果

2.1 溶解氧对含菌量积累的影响 在接种量为20%（体积分数）、转速为100 r/min、温度（25±1）℃、培养周期为7 d、溶解氧为7 mg/L 时，含菌量呈现最高值。见表1。

表1 溶解氧对含菌量积累的影响

2.2 昼夜温差对含菌量积累的影响 以昼夜平均温度25℃为基准，分别采用昼夜温差0℃、2℃、4℃、6℃、8℃和10℃（相应的温度分别是25℃/25℃、26℃/24℃、27℃/23℃、28℃/22℃、29℃/21℃、30℃/20℃），在接种量为20%（体积分数）、溶解氧为7 mg/L、培养周期为7 d、昼夜温差为6℃时，含菌量达最大值。见表2。

表2 昼夜温差对含菌量积累的影响

2.3 发酵时间对含菌量积累的影响 在接种量为20%（体积分数）、溶解氧为7 mg/L、昼夜温差为6℃、发酵周期为7 d 时，含菌量达到最高值，之后随着培养周期的增长，含菌量出现下降的趋势。见表3。

表3 发酵时间对含菌量积累的影响

2.4 接种量对含菌量积累的影响 在发酵液溶解氧为7 mg/L、昼夜温差为6℃、培养周期为7 d 时、接种量为15%（体积分数）时，含菌量达到最高值。见表4。

表4 接种量对含菌量积累的影响

2.5 发酵条件的正交试验优化结果 基于单因素实验结果，选取溶解氧、昼夜温差、发酵时间及接种量作为影响因素，以含菌量为评价指标，采用L9（34）正交表优化。结果显示，对含菌量积累的影响因素作用大小：溶解氧为A3＞A2＞A1、昼夜温差为B2＞B1＞B3、发酵时间为C3＞C2＞C1、接种量为D1＞D2＞D3。表明发酵时间对含菌量积累的影响最大，其他依次为接种量、溶解氧、昼夜温差。天麻蜜环菌发酵优化条件为A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、昼夜温差6℃、发酵时间7 d、接种量15%（体积分数）。见表5、表6。

表5 正交实验因素水平表

表6 发酵条件的正交试验优化结果

2.6 工艺验证结果 为了检验正交结果的可靠性，对分析得出的最优发酵工艺A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、昼夜温差6℃、发酵时间7 d、接种量15%（体积分数），进行了三批工艺验证试验。三批工艺验证试验结果显示，含菌量与正交结果基本一致。见表7。

表7 工艺验证结果

3 结论

有研究表明，非致死低溶解氧胁迫是抑制微生物发酵的重要因素。本研究结果表明，在溶解氧＜3.0 mg/L 时，天麻蜜环菌含菌量显著降低；当溶解氧＞5.0 mg/L 时，实验天麻蜜环菌含菌量与正常及高氧处理组之间无显著差异性。许多研究表明，昼夜温差是影响微生物发酵品质的主要因素。本研究中天麻蜜环菌含菌量随着昼夜温差（0～6℃）增大而增大，但在昼夜温差＞6℃时随之降低，原因可能是较大的昼夜温差下昼温过高，不适宜蜜环菌增殖，增殖速率降低从而导致含菌量降低。合理的发酵周期对微生物发酵品质提升有突出贡献。本研究中天麻蜜环菌含菌量在0～7 d 随着发酵时间的延长而增大，但在＞7 d 后随之降低，原因可能是较长发酵时间下，营养物质消耗过高，不适宜蜜环菌增殖，增殖速率降低从而导致含菌量降低。接种量也是影响发酵罐中天麻蜜环菌生长和含菌量积累最重要的因素之一。接种量过小，不能充分利用发酵液中的营养物质，在相同发酵时间内天麻蜜环菌增量小，要达到最大生长量，会延长发酵时间，降低设备的利用率；接种量过大，天麻蜜环菌竞争有限的营养物质，对天麻蜜环菌的生长不利。天麻蜜环菌含菌量在5%～15%时，随着接种量的增大而增大，但在＞15%后随之降低，原因可能是接种量过大，营养物质供给不足。

本研究通过单因素试验确定了天麻蜜环菌发酵工艺参数的适宜范围，通过正交试验对天麻蜜环菌含菌量有显著性影响的溶解氧、昼夜温差、发酵时间和接种量4 个发酵工艺参数进行了优化，确定最适培养条件为A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、昼夜温差6℃、发酵时间7 d、接种量15%（体积分数）。在此条件下进行了三批工艺验证，进一步验证了该发酵工艺的可行性，可以用于工业大生产。