粮食中真菌毒素和快速定量检测方法的探讨

陈明伟，王 岩，张永君，李俊飞

1.中央储备粮淄博直属库有限公司 (淄博 256499) 2.中央储备粮淄博直属库有限公司高青分公司 (淄博 256400)

粮食是人类赖以生存的根本，也是我们的物质基础，在保证食物美味营养的前提下，我们应该从源头上抓好我们食用的玉米、小麦、大豆等其他作物的安全。我国粮食生产主要集中在高温、高湿区域，导致真菌毒素的污染比较严重，已经威胁到人们的健康和生命安全。粮食中真菌毒素的检测势在必行。同时不断提高粮食中真菌毒素的检测分析技术，对确保国家粮食安全，保障人们身体健康具有重要意义。

1 粮食中的真菌毒素

1.1 真菌毒素的产生

真菌在新陈代谢过程中能够产生大量化学结构各异的生物活性物质，许多这类物质对人和动物具有毒性，被称为真菌毒素。真菌毒素一般分为霉菌毒素和蘑菇毒素两类。与食品关系较为密切的为黄曲霉毒素，赭曲霉毒素等，危害较大的主要有黄曲霉毒素(AFLA),玉米赤霉烯酮(ZEAR/ZEN/F-2)，呕吐毒素(Vomitoxin/DON).赭曲霉毒素(OTA),伏马菌素(FUM)，T2/HT2毒素。

1.2 真菌毒素对人类的危害

1.2.1真菌引起食品变质，真菌毒素能够引起人畜中毒

真菌毒素是农产品的主要污染物之一,人畜进食被其污染的粮油可导致急,慢性真菌毒素中毒。根据联合国粮农组织的调查,全球每年约有25%的粮食受到真菌毒素的污染,约有2%的农作物因污染严重失去利用价值[1]。受气候和储藏等因素的影响，我国是世界上受真菌毒素污染最严重的国家之一。根据国家粮食局不完全统计，每年真菌毒素污染造成的粮油损失累计约3 100万t，超过陕西、甘肃、青海、宁夏、西藏5个西部省区全年粮食产量的总和。

1.2.2真菌毒素具有强毒性和致癌性

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉在生长繁殖过程中所产生的一种对人类危害极为突出的一类强致癌物质，主要作用于动物的肝脏易诱发肿瘤，24周内就能够导致肝脏坏死癌变。黄曲霉毒素B1(AFB1)是目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍，是目前已知最强的化学致癌物之一[2]。呕吐毒素毒性较低，它是一种全球性的谷物污染物，主要毒性作用影响动物免疫系统及胃肠道，受污染的粮食制品能引起人的头痛、头晕、呕吐、腹泻及中枢神经絮乱等。玉米赤霉烯酮具有生殖毒性、肾脏、免疫毒性、肝脏毒性，诱发肿瘤形成。妊娠期的人或动物食用含有玉米赤霉烯酮的食物会引起流产，死胎和畸胎,还可引起中枢神经中毒症状。

1.3 针对真菌毒素污染，我国制定的几种真菌毒素的限量标准

我国国家标准规定玉米及玉米制品中黄曲霉毒素B1的限量20 μg/kg，稻谷、糙米、大米中黄曲霉毒素B1的限量为10 μg/kg；小麦及其他谷物中黄曲霉毒素B1的限量为5.0 μg/kg。我国国家标准规定谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量为5.0μg/kg。我国国家标准规定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量为60 μg/kg。我国国家标准规定谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量为1 000 μg/kg[3]。

2 真菌毒素的测定

2.1 真菌毒素的几种测定方法

国家标准规定的粮油及其制品中真菌毒素的检测方法为薄层层析法、酶联免疫吸附法、仪器方法(气相色谱，液相色谱，质谱等)、快速检测条方法。根据我们目前收购入库的特点，要求检验方法快速，简便，低成本。以上几种方法存在样品前处理复杂，检测成本高，检测速度慢等问题，不适合收购现场检验。目前很多机构检验采用了快速检测条方法。Charm Rosa真菌毒素检测系统与其他真菌毒素检测系统相比具有明显优势，它检测范围宽且不受作物机制的影响,在粮食及其制品中检测的范围和项目最为全面,适合多种基质如玉米、小麦、大米、大豆、高粱、黑麦、燕麦、食用油等粮食及其制品等多种作物，且检测方法均相同。全国257家国家粮食质量监测机构中已有212家配备Charm Rosa真菌毒素定量检测系统。它被称为“便携实用的实验室”。

2.2 Charm Rosa真菌毒素检测的优势

2.2.1采用粮食行业标准

曲霉毒素B1采用LS/T 6111—2015标准，脱氧雪腐镰刀菌烯醇采用LS/T 6113—2015标准，霉烯酮采用LS/T 6112—2015标准，赭曲霉毒素采用LS/T 6114—2015标准。

2.2.2检测项目多

除能检测国家规定的四种真菌毒素(黄曲霉B1，呕吐毒素，玉米赤霉烯酮，赭曲霉A)还可以检测伏马菌素、T2毒素等。

2.2.3Charm Rosa检测速度快

曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、伏马菌素检测时间5 min；赭曲霉毒素A、T2/HT2毒素检测时间10 min可得到准确的定量检测结果。整个操作过程步骤简单，对于操作人员没有较高的要求，适合收购入库快速检验。

2.3 Charm Rosa真菌毒素的定量检测

2.3.1检验原理

试样提取液中的真菌毒素与检测条中的胶体金微粒发生呈色反应，颜色深浅与试样中真菌毒素含量相关，真菌毒素含量越高，检测线颜色越浅。用读数仪测定检测条的颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中真菌毒素的含量。

2.3.2检验材料与仪器

试样：玉米；试剂：蒸馏水、70%甲醇；仪器：粉碎机、离心机、涡旋仪、天平、定量检测条、孵育器、读数仪。

2.3.3检验流程

原始样品→按GB 5491分取→试样约500 g→粉碎试样(全部过20目筛)→混匀样品备用→称样10.00 g→加20.0 mL(70%甲醇)或50 mL(蒸馏水)提取液→漩涡震荡提取(震荡1.5 min)→静置(1 min)→取1.0mL混合液→离心1 min→100 μL上清液+1.0 mL缓冲液→涡旋震荡10 s→一次提取稀释液→加样300 μL→孵育5 min或10 min(45 ℃±1 ℃)→读数→数值≥30+，≥350+，≥1 501+→二次稀释→报告含量。

流程解析: 曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素定量测定加入20.0 mL(70%甲醇)提取液；呕吐毒素定量测定加入50ml(蒸馏水)提取液；根据测定的毒素项目选择对应的缓冲溶液和试剂条。

2.3.4检验结果

DON(呕吐毒素频道)：300 μg/kg；ZEAR(玉米赤霉烯酮频道):5 μg/kg;AFLASL(黄曲霉毒素B1频道):2 μg/kg。

3 真菌毒素定量测定注意事项

(1) 试剂条和缓冲溶液收到后，先检查保质期；并查看缓冲溶液是否有絮状物，絮状物对检测结果干扰大。导致结果不准确。

(2) 使用前检查干燥剂的颜色,正常颜色为蓝色,如果是紫色或粉色说明检测条不可用。

(3) 每次检测结束,剩余检测条应该立即密封并冷藏。

(4) 检测条从冰箱取出后20～30 min左右恢复到室温再使用。

(5) 实验室环境温度最好控制在20 ℃～25 ℃，检测条不用时2.8 ℃密封冷藏保存,首次打开包装桶时,应撕掉铝箔并丢弃,保留塑料盖。

(6) 小心撕开检测条薄膜至指标线处,避免提起检测条和海绵。

(7) 加样时保持移液管垂直,缓慢匀速加入检测液.用力过猛会使溶液直接跑标线上方，影响结果。

(8) 观察c线的清晰度，如果无c线显示检测无效，需重新检测。

(9) 孵育结束后在2 min内读取结果。

4 粮食中真菌毒素的控制

粮食中真菌毒素的污染主要是在收获期和储藏期。通过加强田间管理是抑制真菌毒素产生最有效的方法[4]。在储存过程中控制湿度低于70%，干燥，低温，密封的环境能控制真菌毒素的产生。也可以通过减少氧气，加入二氧化碳的方法制约粮食中真菌毒素的产生。