奶粉中沙门氏菌盲样考核检测分析

唐 刚, 李世艳, 张冬青, 邓晓鸿, 王韦岗

1.蚌埠产品质量监督检验研究院 (蚌埠 233040) 2镇江市产品质量监督检验中心 (镇江 212132) 3江苏国测检测技术有限公司 (苏州 215300)

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于自然界，能使人和动物致病，污染食品引发食物中毒。据统计，全球每年因食品中沙门氏菌污染引起的感染病例数以亿计[1]。微生物实验室的检验能力直接关系到检验报告的准确性和可信度。盲样考核是验证实验室微生物检验能力的有效途径之一，是实验室微生物检测质量控制的关键环节。中国食品药品检定研究院为了验证全国承担国家抽检任务的微生物实验室对沙门氏菌的检测能力而进行了这次盲样考核。

本文按照国家标准 GB 4789.4—2016[2]对收到的编码分别为CODEl～CODE10的10组沙门氏菌盲样考核样品进行了定性检测和结果判定。通过此次盲样考核，微生物检测实验室的检验能力得到了有效验证，实验室管理水平和沙门氏菌检测技术水平得到了有效的提高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样品来源

由中国食品药品检定研究院发放的盲样考核样品10组。编码分别为CODE1～CODE10，样品为白色球状西林瓶装，包含阴性样本和阳性样本；10袋奶粉样品，每袋质量为25 g，编码分别为CODE1～ CODE10。每个相同编码的沙门氏菌样品和奶粉样品作为1组样品进行检测。

1.1.2主要试剂

缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液、亚硫酸铋(BS)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、沙门氏菌显色培养基、三糖铁(TSI)琼脂、沙门氏菌生化鉴定试剂盒、沙门氏菌诊断血清、沙门氏菌阳性菌株CMCC(B)50115等，均购自北京陆桥技术有限责任公司。所有试剂均经过验证[3]并在有效期内使用。

1.2 方法

1.2.1检测依据

依据国家标准 GB 4789.4—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》，对编码分别为CODE1～CODE10的 10组样品进行检测，同时设阳性对照和空白对照。

1.2.2预增菌(按照盒内附作业指导书进行)

在生物安全柜内无菌操作打开西林瓶，取225 mL灭菌BPW增菌液加入到无菌均质袋中，并将西林瓶内白色小球加入到BPW增菌液中，充分溶解。然后再将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述BPW增菌液中，均质混匀。另外同时接种沙门氏菌菌株做阳性对照。放入到36 ℃培养箱中，培养18 h。

1.2.3增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL转种于10 mL TTB内，于42 ℃±1 ℃培养24 h。同时，另取1 mL转种于10 mL SC内，于36 ℃±1 ℃培养24 h。

1.2.4分离培养

将增菌液分别划线到BS平板、XLD平板和沙门氏菌显色平板上培养。

1.2.5生化试验

按照GB 4789.4—2016中5.4规定的方法进行生化试验。

1.2.6血清学鉴定

按照GB 4789.4—2016中5.5规定的方法进行血清学鉴定。

2 结果与讨论

2.1 预增菌

由表1样品增菌结果可以看出CODE5的BPW培养液经过培养后仍澄清透明，培养前后无明显区别，显示无菌生长，与空白对照的结果一致，初步判定CODE5为阴性对照。其他各编号的BPW培养液都变浑浊，显示有菌生长。

2.2 增菌

经过两种培养基增菌后，除CODE5和空白对照仍澄清透明、显示无菌生长外，其他各管的TTB都变浑浊、变黄；SC都变浑浊、变红，显示有菌生长。增菌结果见表1所示。

表1 样品增菌结果

2.3 分离

各样品在选择性平板上划线培养后生长情况见表2所示。CODE5和空白对照培养后显示无菌落生长。CODE5的分离培养结果验证了上述是阴性对照的假设。其余各样品在BS平板上均有黑色菌落生成，有的带金属光泽、周围培养基呈黑色。CODE1、3、7在XLD上有黑色菌落生成，在沙门氏菌显示培养基上有紫红色和蓝绿色2种菌落生成；CODE2、4、6、8、9、10在XLD上有黄色菌落生成，在沙显培养基上有蓝绿色菌落生成；阳性对照在XLD上有黑色菌落生成，在沙显培养基上有紫红色菌落生成。比较可见沙显培养基的分离效果比BS和XLD要好一些。依据沙显培养基说明书，紫红色菌落为沙门氏菌，初步判定CODE1、3、7为沙门氏菌检出。

表2 细菌在各平板上的生长情况

2.4 生化试验

对选择性平板上典型和可疑菌落进行生化鉴定，部分生化鉴定结果见表3所示。依据GB 4789.4—2016标准分析，CODE1、3、7的生化鉴定结果符合沙门氏菌属特性；CODE2、4、6、8、9、10不符合沙门氏菌属特性。

表3 沙门氏菌生化鉴定结果

2.5 血清学鉴定

将生化试验结果符合沙门氏菌属特性的菌株做血清学凝集试验。取单个可疑沙门氏菌纯培养菌落接种于营养琼脂培养基上，于(36±1)℃培养24 h，取纯培养物作为玻片凝集用的抗原，生理盐水作对照，分别进行O抗原和H抗原凝集试验。结果CODE1、3、7均凝集，生理盐水对照不凝集。

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，得出检验结果为编号CODE1、3、7盲样为沙门氏菌阳性(检出)；编号CODE2、4、5、6、8、10盲样为沙门氏菌阴性(未检出)。

3 结论

(1)微生物的培养、分离、鉴定分析，是一项细致严谨的工作，需要做好实验室质量控制工作。要从考核样品中分离出特定的目标菌，排除干扰菌，应尽可能多选择几种增菌液、多选择几种分离平板、多划线平板、多挑几个可疑菌落鉴定分析，防止漏检。

(2)生化试验和血清学鉴定结果是否可靠依赖于菌落的纯培养物，否则容易造成杂菌干扰而严重影响鉴定结果。传统的划线分离这一细节性工作显得尤为重要，应按照可疑菌落大小形态等的不同分别进行纯化培养和后续试验，以达到分离鉴定分析的可靠结果。

(3)沙门显色培养基对杂菌的抗干扰能力明显优于BS和XLD选择性培养基[4]。这是由于沙门显色培养基利用培养基中的细菌特异性酶的显色底物与沙门氏菌特有的辛酯酶反应，从而通过观察菌落颜色就可直接对菌落进行初步判定。本文的检验结果与上述一致。沙门氏菌显色培养基的使用，有助于对可疑菌落的初步判定。传统生化试验和血清学鉴定，可对检验结果进一步验证。