环境因子对卤虫生长、体脂肪酸及抗氧化能力的影响

马 婷，韩朝婕，柴英辉，贾旭颖，高金伟，邵 蓬，窦 勇，周文礼

(天津农学院 水产学院/天津市水产生态与养殖重点试验室，天津 300384)

【研究意义】卤虫(Artemiaparthenogenetic)也称盐水丰年虫，在分类上属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳亚门(Crustacea)、鳃足纲(Branchiopoda)、无甲目(Anostraca)、卤虫科(Artemiidae)、卤虫属(Artemia)[1]。卤虫分布范围极广，在世界各大陆的盐湖、盐田等高盐水域均有分布。卤虫是良好作为基础研究材料，其已被广泛应用于生物的生长[2]、发育[3]、遗传[4]、进化[5]等各个方面研究。同时又因其适口性强、营养价值高、可作为药饵及微量元素的活载体、能够提高养殖生物的存活率、抗病性等优点，成为水产养殖生物广泛使用的开口饵料[6]。卤虫体内含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸等营养成分，其体内含有的脂肪酸尤其是不饱和脂肪酸对水产生物的生长发育、免疫防御、能量代谢等均有积极影响[7]。【拟解决的关键问题】虽然卤虫体内不饱和脂肪酸含量高于饱和脂肪酸，但其整体水平较低，仍无法满足多数海水鱼、虾苗种发育的需要，所以在大规模养殖生产上中一般使用鱼油[8]、葡萄糖[9]进行卤虫脂肪酸强化，这不仅提高了养殖成本，而且限制了卤虫作为开口饵料在海水养殖育苗生产中的应用。与其他强化物相比，生物饵料是一种可持续的资源，能够在任何季节迅速繁殖、生长和收获，且生长周期短、适于高密度培养[10]。生物饵料中的微藻[11]被广泛应用于水产养殖过程中的各个阶段，能够在不同程度上满足水产养殖动物各个时期的营养需求。卤虫是典型的滤食性生物，在天然环境中主要以细菌、微藻和有机碎屑等为食，养殖生产中常用的生物饵料主要有球等鞭金藻、海水小球藻、酵母等，均作为饵料广泛应用于卤虫饲养及营养强化。【前人研究进展】研究发现卤虫的生长、繁殖状况不仅与饵料种类和质量有着密切的关系，而且受到外界理化因素的影响[12]，对于卤虫等甲壳类动物来说，其生长主要受温度[13]、盐度[14]、pH[15]、溶解氧[16]、光照[17]等环境因子的影响，环境因子还在一定程度上影响卤虫机体渗透压[18]、耗氧率与排氨率[19]、繁殖[20]等生理功能。隋丽英等[21]研究了盐度对不同品系卤虫的影响，发现盐度为70～180的范围内，旧金山盐田卤虫(SFB)、渤海湾孤雌生殖卤虫(BHB)和越南人工养殖两性卤虫(VSFB)的存活率随盐度的升高而降低；宋雨晴[22]研究了海洋单胞藻对卤虫生长的影响，发现卤虫的体长受饵料脂肪含量的影响更明显；彭瑞冰等[23]研究了不同饵料对卤虫总脂含量、脂肪酸组成的影响，发现以三角褐指藻或“三角褐指藻+酵母液”为饵料培养的卤虫总脂和不饱和脂肪酸成份较高，其营养价值最佳；孙学亮等[24]探究了盐度对对虾等甲壳类动物的抗氧化能力的影响，发现盐度为15试验组会显著降低甲壳动物的抗氧化能力及非特异性免疫能力，相比之下，盐度为25的试验组甲壳动物更加健康。【本研究切入点】目前针对卤虫最适养殖环境的研究多集中于单一的环境因素影响[25]，此外对卤虫的营养强化技术的研究也大多针对饵料种类这一单一因素[26-27]，而忽略了多因子之间的相互作用以及常见环境因子与生物因子对卤虫生理生化等指标的综合影响。【拟解决的关键问题】本试验将常见的理化因素(光照、盐度、pH)与营养强化最重要的生物因素-饵料种类相结合，综合4种环境因素进行正交试验，探究环境因子对卤虫生长、体脂肪酸成分及体抗氧化指标的影响，旨在获得最适合卤虫生长发育、脂肪酸积累以及提高免疫力的环境条件组合，为卤虫营养强化技术提供理论依据，以期为水产经济动物提供更优质饵料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 卤虫 试验所用卤虫卵由天津海友佳音生物科技有限公司提供的渤海湾孤雌生殖卤虫(ArtemiaparthenogeneticBHW) ，放置于冰箱4 ℃密封待用。卤虫孵化方法参考[28]，使用人工调配的海水进行孵化，盐度为25 ‰；孵化时持续充气，保证卤虫卵均匀分布，孵化水温25 ℃，光照强度为72 μmol/(m2· s)，取时龄< 24 h，体长为(0.5±0.05)mm的卤虫无节幼体待用。采用温度计监测水温，盐度计监测水环境的盐度，照度计检测各试验组的光照强度，并及时利用白炽灯补光。

1.1.2 饵料 球等鞭金藻、海水小球藻、食用酵母均由天津农学院水生生物生态试验室提供。藻液采用f/2培养基，将球等鞭金藻、海水小球藻置于温度为26 ℃、光照为72 μmol/(m2.s)，光照周期为12∶12(L∶D)的光照培养箱中进行扩大培养。待藻细胞密度达到5×106cell/mL时离心备用。酵母为食用安琪干酵母，投喂前用海水稀释，放置于4 ℃冰箱密封保存。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 正交试验设计方案见表1。利用SPSS19.0设计的四因素三水平正交试验表共有九组(表2)。

表1 四因素三水平正交试验设计方案

表2 四因素三水平正交试验表

1.2.2 试验方法 试验用卤虫无节幼体分为9个试验组，每个试验组设置3个重复，试验期间养殖水体温度为(28±1)℃，溶解氧≥ 6.5 mg/L，饵料按不同种类同等密度投喂，每天07:00、13:00和19:00投喂3次，投喂密度为(1.0±0.2)×106cell/mL。每天监控养殖条件，及时调节。试验期间每天取样测定其存活率、体长、体重、体脂肪酸及抗氧化指标。采用温度计、盐度计监测水温、水环境的盐度，照度计检测各试验组的光照强度，并及时利用白炽灯补光。体长采用Olympus光学显微镜和台微尺进行测定，湿重采用电子天平测量。

卤虫存活率=n/N×100%

其中,n：卤虫量，N：卤虫的全部个体数量。

卤虫体脂肪酸测定方法参考GB 5009.168-2016[29]。

抗氧化相关酶活和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定。SOD活力单位(U)定义每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50 %时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。CAT活力单位为每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的H2O2的量。POD活力单位为37 ℃条件下，每毫升组织每分钟催化1 μg底物的酶量。

1.3 数据处理

所有数据均以“平均值±标准误(Means±SE)”表示，用SigmaPlot 13.0软件绘制图形，利用SPSS19.0统计软件进行主效应检验，并用Duncan’s进行组间的多重比较，设P≤ 0.05为显著性差异水平。

2 结果与分析

2.1 环境因子对卤虫存活和生长的影响

如图1所示，试验期间，第4组卤虫存活率最高，为71.36 %，显著高于除第五第九组以外的其他处理组(P<0.05)，其次为第1、3、5、8、9组，存活率在58.77 %～65.61 %，第2、6、7组存活率最低，仅为45.36 %～46.55 %，显著低于其他处理组(P<0.05)。主效应检验表明：4种因子对卤虫存活率影响的主次关系为：pH >盐度>饵料种类>光照强度。

所有图中字母不同表示差异显著(P<0.05)，下同

如图2所示，试验初期各处理组体长无显著差异，随着试验时间的延长，各组体长差异明显。试验结束(7 d)时，第9组卤虫的体长最大，为2.38 mm，显著高于其他处理组(P<0.05)，其次为第1、3、4、5、8组，而第2、6、7组卤虫的体长最小，体长在1.665～1.735 mm，显著低于其他处理组(P<0.05)。由主效应检验可知，4种因子对卤虫体长影响的主次关系为：pH >光照强度>盐度>饵料种类。

图2 环境因子对卤虫体长的影响Fig.2 Effect of environmental factors on the body length of Artemia parthenogenetic

如图3所示，试验初期，各组体长无显著差异，试验中期(3～5 d)体重增长明显，增重最快，各组体重差异明显。试验结束时(7 d)组的卤虫体重最大，为(0.201±0.013)mg，显著高于其他试验组(P<0.05)；其次为第5和9组，体重分别为(0.160±0.01)和(0.161±0.008)mg；第6、7组卤虫体重处于较低水平；第2组的卤虫体重最低，仅为(0.081±0.01)mg，显著低于其他处理组(P<0.05)。环境因子对卤虫体重主效应的检验关系依次为：pH >饵料种类>盐度>光照强度。

图3 环境因子对卤虫体重的影响Fig.3 Effects of environmental factors on Artemia parthenogenetic weight

2.2 环境因子对卤虫体内脂肪酸组成及含量的影响

如图4所示，第四组卤虫体脂肪酸总量、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量均高于其他处理组，其次为第1、3、5、7、9组，而第2、6、8组4种脂肪酸相关指标均显著低于其他处理组(P<0.05)。主效应检验结果表明：4种环境因子对卤虫饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸影响的主次关系为pH>饵料种类>盐度>光照，而对脂肪酸总量的影响关系为饵料种类>pH>盐度>光照。

图4 环境因子对卤虫体脂肪酸组成种类及含量的影响Fig.4 Effect of environmental factors on the types and contents of fatty acid composition of Artemia parthenogenetic

2.3 环境因子对卤虫抗氧化力的影响

如图5所示，试验期间第四组卤虫SOD、CAT和POD酶活性均高于其他试验组(P<0.05)，其次是第8、5、3、6组，再次是9、2、1、7组等，而MDA含量第四组低于其他试验组(P<0.05)，第8、3、6、9组较高。主效应检验结果表明：卤虫POD和SOD酶活力主次关系为盐度>光照> pH>饵料种类，卤虫CAT酶活力主次关系为pH>盐度>饵料种类>光照，卤虫MDA含量的主次关系为饵料种类>光照>pH>盐度。

图5 环境因子对卤虫抗氧化力的影响Fig.5 Effects of environmental factors on the antioxidant capacity of Artemia parthenogenetic

3 讨 论

3.1 环境因子对卤虫存活、生长的影响

卤虫是生活在高盐水体中的一种小型甲壳动物[30]，盐度是卤虫养殖环境中重要的因子之一。吕光俊[31]研究表明山东盐场卤虫在盐度为50下生长最快，在盐度为5时孵化率最高，卤虫在低盐度孵化率较高高盐度生长最快。R Blust等[32]研究了pH在5.5～8.5卤虫的生长情况，发现pH较低条件下卤虫存活率较低，生长缓慢；在pH为8时卤虫适应能力最强，表明pH过低会抑制卤虫的生长发育。田树林等[33]对山西运城卤虫休眠卵孵化特性进行了研究，发现光照对卤虫休眠卵的孵化有显著影响，与黑暗条件相比，光照条件下卤虫孵化率提高10 %以上，生长速度明显提高，表明光照可以促进其孵化和生长。张登沥等[34]研究了盐藻、麸皮、酵母对卤虫生长和生殖的影响，发现不同饵料对卤虫的存活和生长速度均有显著影响，其中(P<0.05)麸皮组生长最好，而酵母组最差；达到性成熟时盐藻组存活率最高，酵母组存活率则最低对，说明卤虫的存活与生长状况与其饵料种类有着密切的关系。本研究发现对卤虫存活、体长和体重起主要影响作用的环境因素均是pH，实验结束时第3、4、8、9组卤虫的存活率最高，此时pH范围在8～9，第2、6、7组卤虫的存活率最低，体长最小，3组的pH条件均为7，表明pH8～9有利于卤虫的存活，而pH 7的水体在一定程度上限制了卤虫生长。本实验中第4组的存活率和体重均高于其他处理组，而体长则高于除第九组外的其他处理组，说明其存活和生长的最佳条件为第四组，其环境因素组合是光照强度为72 μmol/(m2·s)、盐度为25、pH为8.0、饵料种类为球等鞭金藻。

3.2 环境因子对卤虫体脂肪酸组成及含量的影响

目前理化因子对卤虫体脂肪酸影响的研究较少，研究着重在饵料对卤虫体脂肪酸影响的方向。有研究指出盐度升高，除C22:0显著高于其它组别外，盐度变化对卤虫脂肪酸含量均无显著影响(P>0.05)[35]，其他因子对卤虫脂肪酸的影响尚未明确。饵料为水产生物提供主要代谢能量来源，对水生生物的发育、生长与繁殖有重要意义影响[36]。而饵料对卤虫生长、生殖的影响大部分的研究测重于啤酒酵母、混合单胞藻、螺旋藻粉、农副产品(如米糠、麸皮、豆粕等)、植物浆等对卤虫的饵料效果，发现在卤虫生长前期，农副产品饲养卤虫的生长速度高于其他种类饲料，在卤虫生长的中后期混合单胞藻和螺旋藻粉对卤虫的生长和存活较高与其他饵料，而酵母对卤虫的影响最差[37]。并且卤虫的趋光性，致使在不同光照强度的作用下卤虫的游泳行为不同，从而导致各试验组的卤虫体代谢和耗能情况出现较大差异[38]。Watanabe等[39]研究发现生物饵料饲养的卤虫体内脂肪酸组成成份的种类与数量都显著优于普通饵料饲养的卤虫。本研究结果表明pH和饵料种类是影响卤虫脂肪酸种类和含量的两个主要环境因子，说明适宜的理化条件(尤其是pH)对卤虫体脂肪酸的积累有着明显的促进作用，可能是由于在适宜的理化条件中，卤虫才得以正常活动，能量消耗与转换才能维持稳态，保持机体营养均衡；当环境中的理化条件不适时，机体用于适应环境的能量消耗过大，机体的能量转换下降，从而导致营养储存较低，营养缺失。本实验中第四组的脂肪酸总量和不饱和脂肪酸含量均显著高于其他处理组，说明卤虫脂肪酸积累最佳条件为第4组。

3.3 不同环境组合对卤虫抗氧化力的影响

抗氧化系统是机体清除体内多余的活性氧、保护自身免受氧化损伤的重要体系，是相互关联的。超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，SOD酶能清除超氧阴离子自由基，保护机体细胞免受侵害[40]；过氧化氢酶(CAT)分解活跃的氢氧自由基(OH·)，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活；过氧化物(POD)与生物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化都有着密切的关系，在整个生物的生长发育过程中POD的活性不断发生改变[41]；MDA则是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用所产生的脂质过氧化物，且MDA能使机体组织细胞受损伤[42]。本研究结果表明4种环境因子对卤虫四种抗氧化指标的影响主次关系略有差异，理化因子对卤虫抗氧化相关酶活具主要影响，其中盐度对卤虫的POD、SOD酶活力影响较大，说明适宜盐度条件下卤虫机体可以促进过氧化物的生成和增加超氧阴离子，保护机体细胞，促进卤虫的生长；而CAT受pH影响较大，主要是由于水体pH影响机体内氢氧自由基的产生，pH较低时氢氧自由基数量降低，细胞内环境不平衡；pH较大时，促进细胞内环境内环境的稳定。而生物因子-饵料种类对MDA含量具有主要影响，说明机体内脂质过氧化物的形成与消除不仅与酶活性水平相关，同时也与适宜的饵料种类和自身营养状态有关。其中第1、4组的卤虫MDA含量较低，这两组的卤虫机体细胞损伤较低，且这两组的饵料均为球等鞭金藻，说明投喂球等鞭金藻阻碍机体细胞的损伤，减少机体内MDA含量的累积；主效应检验得出；本试验结果中第4组的SOD、CAT和POD酶活力均高于其他各试验组，说明第4组饲养的卤虫体内氧化损伤程度显著低于其他各试验组，能够有效的修复受损细胞，加强代谢机体产生的有害成分，加强自身的防御作用，降低自身伤害；同时第4组的MDA含量最低，说明卤虫体内对组织的保护能力最强，细胞膜抵抗胁迫遭破坏的能力提高[43]，说明第4组养殖条件下卤虫的抗氧化能力优于其他养殖条件。

4 结 论

综上所述，环境中的理化因子尤其是pH和盐度对卤虫存活、生长和抗氧化性能的影响效果最大，而生物因子——饵料种类则对卤虫体脂肪酸积累起主要影响作用。综合卤虫生长、体脂肪酸和抗氧化性能指标，其最佳饲养条件为光照72 μmol/(m2·s)、盐度25、pH 8、饵料种类为球等鞭金藻。