不同盐度下脊尾白虾proPO 和SOD 基因表达及其酶活力分析

许振山， 张 静， 张伟丽， 梁俊平，， 李 健， 李吉涛

（1. 河南师范大学水产学院，河南 新乡453007；2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛266071）

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是一种小型经济虾类，广泛分布于中国沿海和朝鲜半岛西岸的浅海水域，生长速度快，适应性广[1-2]，特别是对盐度具有较强的适应性，在河口及浅海区域均可正常生存，甚至通过逐渐淡化可在淡水中生存[3]。梁俊平等[4]研究发现，脊尾白虾在5-30盐度下，可正常抱卵、孵化，但在不同盐度下，子代生长速度差异显著，其最适生长盐度为20，在此盐度下Na+-K+-ATPase mRNA表达量也最低，可能是在此盐度下，渗透压调节耗能较小，更多的能量用于了生长。研究表明，盐度不仅会影响甲壳动物生长、繁殖，而且会影响甲壳动物免疫防御能力。Wang等[5]研究发现，当凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）从盐度为25的水体中转移到盐度为5和15的水体中后，其酚氧化酶（phenofoxidase，PO）活力均有所下降，而转移到35的水中，其PO活力显著增加。叶建生等[6]研究也发现，盐度突变对凡纳滨对虾免疫酶活有显著影响，当从盐度30突变到27、24、21等不同盐度后，超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）酶活力显著降低。王瑞芳等[7]对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）急性盐度胁迫后发现，PO活力随盐度逐渐升高呈显著下降趋势。由此可见，急性盐度变化对甲壳动物免疫力有重要影响。

李玉全、李洋等[8-10]对脊尾白虾急性盐度胁迫后发现，无论是高盐度突降到低盐度或是低盐度骤升到高盐度，都会对SOD、PO活力产生负面影响。那么，对于长期生活在不同盐度水体中脊尾白虾，其生长速度与其免疫力是否存在某种相关性？本研究选择长期生活在不同盐度下的脊尾白虾，比较了不同盐度下脊尾白虾肝胰腺proPO和SOD基因表达及其酶活力水平，以期为不同盐度水域脊尾白虾健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

性成熟脊尾白虾亲虾经逐渐淡化后，养殖于盐度30、25、20、15、10、5水体中，在此6个盐度下交尾抱卵，直至幼体孵化，并继续培育。本实验选取不同盐度下生长的幼虾，养殖于200 LPVC桶，水温18℃，充气。

1.2 实验方法

1.2.1 取样及样品处理

每个盐度设3个重复，每个重复取5尾脊尾白虾，迅速解剖取肝胰腺置入1.5 mL无RNA酶离心管，放入液氮冷冻。之后将肝胰腺放入研钵，加液氮研磨成粉末，一部分研磨样品转移至离心管，加入预冷PBS 缓冲溶液，漩涡震荡，4℃800×g离心10 min，吸取上清液，置-80℃保存用于酶活力测定。取另一部分研磨样品转至1.5 mL无RNA酶离心管(内含1.0 mL TRIzol液)，漩涡震荡，置-80℃保存用于总RNA提取。

1.2.2 酶活力测定

采用试剂盒（南京建成生物工程研究所生产）测定SOD活性，采用改进的Ashida方法和雷质文等[12]方法测定PO活性。

1.2.3 proPO基因和SOD基因表达分析

采用Trizol法提取脊尾白虾肝胰腺RNA，用MOPS琼脂糖电泳检测总RNA的完整性，按照M-MLV反转录试剂盒说明书合成cDNA。根据GenBank中脊尾白虾proPO基因和SOD基因序列，分别设计荧光定量特异引物，内参基因为actin，所用引物如表1所示。利用荧光定量PCR对不同盐度下脊尾白虾肝胰腺proPO基因和SOD基因的表达量进行检测，每个样品3个重复。PCR反应体系及扩增程序按照SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)试剂盒说明书进行。所得实验数据采用2-△△CT法计算各基因的相对表达量。

1.3 统计分析

各盐度下酶活力和基因表达量以平均值±标准差（X±SD）表示，采用SPSS16.0软件中单因子方差分析(one-way-ANOVA)检验显著性差异(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺proPO基因表达量和PO活力变化

如图1所示，随着盐度升高，脊尾白虾肝胰腺proPO基因表达量呈现先升高后降低趋势，盐度15和20两组间的proPO基因表达量无显著性差异（P＞0.05），但显著高于其它盐度组的表达量（P＜0.05）。脊尾白虾肝胰腺PO活力也呈现先升高后降低趋势，盐度15 和20 两组间的酶活力无显著性差异（P＞0.05），但显著高于其它盐度组的酶活力（P＜0.05）（图2）。

图1 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺proPO基因表达量变化Fig.1 Effect of salinity on proPO mRNA levels of E. carinicauda

图2 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺PO活力Fig.2 Effect of salinity on PO activities of E. carinicauda

2.2 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺SOD基因表达量和SOD活力变化

如图3所示，随着盐度升高，脊尾白虾肝胰腺SOD基因表达量呈现先升高后降低趋势，盐度15和20时的SOD基因表达量显著高于其它盐度组基因表达量（P＜0.05）；肝胰腺SOD活力变化趋势与其基因表达趋势相同（图4）。

图3 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺SOD基因表达量变化Fig.3 Effect of salinity on SOD mRNA levels of E. carinicauda

图4 不同盐度下脊尾白虾肝胰腺中SOD活力Fig.4 Effect of salinity on SOD activities of E. carinicauda

3 讨论

3.1 不同盐度下脊尾白虾proPO基因表达量及PO活力变化

酚氧化酶（phenofoxidase，PO）在甲壳动物的非特性免疫反应中发挥着重要识别和防御作用[13]。一般情况下，PO以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase，proPO)形式存在，β-1，3-葡聚糖（β-1，3-G）、脂多糖、胰蛋白、加热、Ca2+浓度下降等都可以激活proPO系统，引发酶级联反应，生成有活性的PO[8]，对病原体起到抑制作用或杀死病原体，从而可降低微生物对宿主的感染几率[8-14]。本研究显示，长期生活在不同盐度水体中的脊尾白虾，PO活力随着盐度升高均呈现先升高后降低趋势，在盐度15和20时的酶活力显著高于其它盐度组，同时proPO基因mRNA表达量也呈现相似趋势。前期研究发现，脊尾白虾在盐度17.5左右表现出最快生长速度[4]，与PO活力变化趋势基本一致。这说明在此盐度下，脊尾白虾proPO系统可被有效激活，以提高自身免疫力应对环境变化。

当凡纳滨对虾从盐度为25的水体中转移到盐度为5和15的水体中后，其PO活力均有所下降，而转移到35的水中，其PO活力有所增加[5]，说明不适盐度降低了凡纳滨对虾的免疫力。在中华绒螯蟹研究中也发现，与淡水组相比，随着盐度逐渐升高，中华绒螯蟹雄蟹PO活力呈显著下降趋势[15]。而当凡纳滨对虾仔虾养殖在盐度2.5、5、15、25、35水体中24周后，盐度15、25、35时PO活力显著高于盐度为2.5和5 的活力；通过溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和WSSV感染后发现，盐度15、25、35时的死亡率显著低于盐度为2.5和5的死亡率，研究认为凡纳滨对虾在低盐度下抗病力降低与体内PO活力降低有关[16]。本实验结果与上述研究结果相一致，说明PO酶活力可作为评价脊尾白虾不同盐度下免疫力强弱的指标。李洋等[8]研究显示，不同盐度急性胁迫后，低盐度下脊尾白虾proPO基因表达量在短时间内显著高于高盐度组，而当胁迫48 h后，各盐度下proPO基因表达量趋于稳定且无显著性差异，与本实验结果有相似之处，但也有一定差别。可能是由于不同实验所选实验动物生活环境不同所导致，李洋等[8]所选的脊尾白虾为生活在盐度32的成虾，对盐度适应性较强，短时间内对盐度变化导致免疫酶活变化显著，而后适应了各盐度条件。而本实验所选脊尾白虾幼虾为在各盐度下孵化而来，从幼体阶段一直生活在其各自盐度环境条件下，其免疫酶活是各盐度下长期适应下的反映。

3.2 不同盐度下脊尾白虾SOD基因表达量及其酶活力变化

SOD是机体内重要的的抗氧化酶之一，可以阻断因自由基造成的细胞损伤，并及时修复损伤细胞，在抗氧化方面发挥重要的生理作用[17]。在凡纳滨对虾成虾中研究发现，当盐度从30突变到27、24、21等低盐度后，盐度突变组SOD活性显著低于对照组[6]。当盐度从12骤降到8或5时，凡纳滨对虾仔虾SOD活性也显著降低[18]。李玉全等[10]研究发现，当盐度从33降低到5或升高至45 时，都会对脊尾白虾SOD活力产生负面影响，而对照组盐度33时的SOD 活力维持在最高水平。由此可见，当甲壳动物处于最佳生活环境下，其免疫力也最强，而环境突变可能会显著影响其免疫力。本研究显示，长期生活在不同盐度水体中的脊尾白虾，SOD活力随着盐度升高均呈现先升高后降低趋势，在盐度15和20时的酶活力显著高于其它盐度组，SOD基因mRNA表达量也呈现相似趋势。梁俊平等[4]研究发现，脊尾白虾在盐度17.5左右表现出最快生长速度；姜巨峰等[19]也发现，脊尾白虾在盐度15、20时的特定生长率显著高于其它盐度组。说明脊尾白虾在盐度15-20时表现出最快生长速度与其具有较强免疫力密切相关。