肽锌螯合物研究进展

李晨，陈复生，布冠好

河南工业大学粮油食品学院（郑州 450001）

锌被称为“生命元素”，对于维持人体正常的生命活动和生理状态起着不可替代的作用。缺锌会使人体健康受损，儿童缺锌会延缓其生长发育，成人缺锌会损伤机体的性腺机能，同时会导致神经机能障碍以及免疫功能失调[1]。补锌主要通过2种途径：一是利用富锌食物进行补锌；二是通过服用补锌剂进行补锌。补锌剂主要有4种形式：以无机锌盐作配体合成的补锌剂、以有机弱酸作配体合成的补锌剂、以氨基酸作配体合成的补锌剂和以肽作配体合成的补锌剂[2-3]。研究发现，食物衍生肽由于其锌螯合能力可以作为膳食锌载体[4]。一些肽结构中含有金属配体，如His、Cys、Asp、Glu和Ser，它们可以形成可溶性锌螯合物，从而增强矿物质的吸收性并防止其与植酸盐的络合。许多食物蛋白中可以提取出锌螯合肽，例如芝麻蛋白[1]、乳蛋白[5]、牦牛酪蛋白[6]和牡蛎蛋白[7]。并且相对于无机锌盐而言，肽锌螯合物中的锌能被胃肠更好地吸收[8]。

肽锌螯合物通过肽的C端羧基、N端氨基、氨基酸侧链以及肽链中的亚氨基和羰基与锌离子配位形成。它不仅提高了锌离子的生物利用率，同时还具有高生物活性、高安全性和高溶解性，具有非常广阔的研究前景。因此，主要对肽锌螯合物的研究现状予以概述，以期为肽锌螯合物的未来应用和进一步深入研究提供参考。

1 肽锌螯合物及其制备

1.1 肽锌螯合物的制备

肽锌螯合物以共价化学键作用肽和二价金属锌离子，生成化学性质较为稳定的多元环状螯合物[9]。肽中α-氨基酸羧基端的碳原子、氨基端的氮原子及侧链中含有诸如硫基、咪唑基和酚基等基团，在适当条件下可以作为配位体与二价金属锌离子发生共价作用，形成十分稳定的肽锌螯合盐。

锌螯合肽的初步制备主要是通过物理、化学等方法将蛋白分解成多肽。由于酶解法具有成本低、安全性高、条件温和、水解过程易控制等优点，逐渐发展为锌螯合肽初期制备的主要方法[10]。周亮[11]以草鱼鳞为原料，利用碱性蛋白酶酶解胶原蛋白，采用水相法进行胶原小肽与锌离子的螯合反应，并确定最佳提取工艺：时间75 min、温度70 ℃、pH 6.5、肽锌摩尔比2∶1.2，此条件下锌肽螯合比率（质量比）为5.79%。牟雪姣等[12]以木瓜蛋白酶结合中性蛋白酶法制备玉米蛋白水解物，并在pH 8.0，玉米蛋白水解物与锌质量比3∶1的最佳条件下进行肽锌螯合，该条件下螯合物得率和螯合率分别为77.8%和97.7%。李庭[13]确定复合胰蛋白酶米渣限制性酶解最佳工艺条件后，由单因素试验和正交试验确定螯合最佳工艺条件：米蛋白肽与二价锌质量比4.56∶1，pH 5.0、螯合温度60℃、螯合时间90 min，此条件下米蛋白肽螯合锌的锌含量为15.33%。高红梅等[14]、侯利霞等[15]、张亚茹[16]分别从谷朊粉蛋白、芝麻蛋白、榛子蛋白中提取锌螯合肽，并制备相应肽锌螯合物。

影响肽与锌离子螯合反应的因素有反应时间、pH、温度和物料的质量比等，不同的螯合工艺所得的螯合产物的理化性质和螯合率都有所差异[17]。高素蕴[18]通过对大豆源肽锌螯合物制备工艺条件的研究表明pH对螯合反应影响最大，其后依次是酸度调节剂、肽锌质量比、多肽反应液浓度、锌盐种类、反应时间和温度，它们对锌的螯合率及螯合物得率有较显著影响。除了常规的螯合反应外，有学者借助超声波手段辅助反应。闫伟[19]在超声辅助条件下将真鲷鱼皮胶原蛋白多肽与硫酸锌进行螯合反应，同常规螯合反应相比，超声波明显加快螯合反应的进行，减短螯合反应的时间，并且提高螯合率，螯合率达96.07%。

1.2 锌螯合肽的分离与纯化

肽锌螯合机理是近年来的一大研究热点，研究螯合肽螯合机理首先需要将锌螯合肽进行分离纯化。螯合肽的分离纯化方法有凝胶柱层析、固定化金属亲和层析、离子柱层析和超滤等。电喷雾电离质谱和反相高效液相色谱也已被广泛应用于获得单个肽分子及其肽序列[20]。

张亚茹[16]将榛子蛋白水解产物超滤处理后，5～10 kDa肽段的螯合率和螯合物得率分别为47.89%±0.27%和16.90%±0.20%。将其经离子交换层析分离获得F1和F2这2个组分，经Sephadex G-25凝胶柱层析分离获得F3和F4这2个组分，其中F2组分对锌的螯合能力最强，螯合率为59.855%±0.45%。

Chen等[7]通过固定化金属离子亲和色谱（IMACZn2+）分级分离牡蛎蛋白水解产物。通过反相高压液相色谱鉴定并通过液相色谱质谱法测序的牡蛎锌螯合肽（从N至C末端的序列）具有1 882.0 Da的分子量。肽（HLRQEEKEEVTVGSLK）的锌结合能力为6.56 μg/mg，并且在体外模拟消化时保持其原始水平的85.98%。UV-vis和FTIR光谱表明，属于羧酸盐基团的氨基氮原子和氧原子是Zn2+的主要结合位点。

黄晶晶等[21]用碱性蛋白酶水解菜籽蛋白制备水解物，运用固定金属亲和层析（IMAC-Zn2+）和葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25）层析分离纯化锌螯合肽，利用反相高效液相色谱和电喷雾电离质谱鉴定序列。研究发现，其中Asn-Ser-Met锌螯合率最高，它来源于菜籽蛋白NADH-enoyl-ACP reductase Chain A序列中的296～298氨基酸残基。

Zhu等[22]以小麦胚芽蛋白为原料，使用固定化金属离子亲和层析（IMAC-Zn2+）和大孔吸附树脂DA201-C，从小麦胚芽水解产物中分离和纯化锌螯合肽。通过MALDI TOF/TOF鉴定的2种主要锌螯合肽是NAPLPPPLKH和HNAPNPGLPYAA。其中，HNAPNPGLPYAA具有91.67%±0.81%的高锌螯合能力，并且在Caco-2细胞中具有比ZnSO4更高的锌生物利用度（p＜0.05）。

Wang等[1]使用固定化金属亲和层析（IMAC-Zn2+）从胰蛋白酶处理的芝麻蛋白水解产物中分离金属螯合肽。此外，用反相高效液相色谱和质谱鉴定6种锌螯合肽。合成这些金属螯合肽中的3种（Ser-Met、Leu-Ala-Asn和Asn-Cys-Ser），并检测肽的金属螯合能力。Asn-Cys-Ser肽显示出最高的锌和铁螯合能力，甚至高于还原型谷胱甘肽。

2 肽锌螯合物的主要特性

2.1 肽锌螯合物的功能特性

肽锌螯合物可以通过削弱不溶性锌化合物的形成来改善消化道中的矿物质吸收，促进锌通过肠道吸收膜的转运[23-24]。Wang等[25]报道，牦牛乳酪蛋白水解物（YCH）可与锌离子结合形成复合物，使锌在模拟肠道条件下比醋酸锌更易溶解。Zhu等[22]发现，与来自小麦胚芽蛋白的肽螯合锌在Caco-2细胞中具有比ZnSO4更高的锌生物利用度。马婷等[26]研究表明珍珠贝外套膜胶原蛋白肽锌螯合物（POMCP-Zn）可以提高骨钙素蛋白的分泌量，促进成骨细胞分化阶段Ⅰ型胶原蛋白，同时有利于成骨细胞矿化阶段骨结节的形成。10 μg/mL的POMCP-Zn将成骨细胞的碱性磷酸酶活性提高到1.48倍，有望成为预防骨质疏松症的潜在功能性食品。有研究表明，牡蛎肽锌螯合物具有改善抗氧化剂生物活性和锌生物可接近性的潜在功能成分[27]。除了促进矿物质生物利用度之外，还观察到肽-金属络合物的抗微生物活性[28]。

由于世界对化学防腐剂的认识，食品行业正在关注天然GRAS（通常认为安全）防腐剂及消费者对更安全添加剂的看法[29]。抗菌肽（AMPs）作为化学防腐剂的抗菌替代品受到关注。AMP是各种生物体中非特异性宿主防御或先天免疫系统的重要组成部分。当这些肽与二价金属离子如锌复合时，抗微生物肽的活性增加[30-31]。研究表明由风味酶水解产物制备的肽-锌复合物（PZCs）表现出最高的抗菌活性。其中5种PZCs均具有较强的抗菌活性，但无抗真菌活性。在序列中具有更多酸性氨基酸残基的肽可以比具有更少酸性氨基酸残基的肽结合更多锌离子，富含酸性氨基酸的肽的锌配合物显示出更强的抗菌活性[32]。除此之外，有学者表征了由杆菌肽-锌对金黄色葡萄球菌的抗菌活性的机制[31]。

有研究表明，鲢鱼源多肽锌螯合物对冷藏过程中的草鱼有明显的防腐保鲜作用，能减缓草鱼感官品质的下降，有效抑制草鱼TBA值、TVB-N值、pH升高及细菌生长，与未添加多肽锌的涂膜处理组草鱼相比，多肽锌处理后草鱼的保鲜期可延长4 d[33]。

研究表明肽锌螯合物还具有一定的抗氧化能力和促进乳酸菌增殖的能力。在试验浓度范围内，肽锌螯合物的浓度与羟自由清除能力、总还原力和ABTS阳离子自由基清除能力均呈正相关。在MRS培养基中，肽锌螯合物部分替代MRS培养基中的有机氮源时，肽锌螯合物会在一定程度上促进乳酸菌的生长；肽锌螯合物完全替代MRS培养基中的有机氮源时，反而会抑制乳酸菌的产酸活力和人乳酸菌的生长繁殖。在脱脂乳培养基中，乳酸菌的产酸活力和乳酸菌的生长繁殖会随着添加肽锌螯合物量的增加更增强[34]。

除此之外，通过使用高通量表面等离子体共振（SPR）分析研究，发现新型锌结合肽已显示出在确保遗传物质稳定性的试验条件下具有mcDNA结合和回收的合适性质。更重要的是，采用简单的仿生配体进行mcDNA捕获的直接方法有助于开发纯化DNA生物制药的新技术[35]。

2.2 肽锌螯合物的稳定性

肽锌螯合物在胃相中的稳定性是矿物质输送的重要因素。在胃消化期间从肽锌螯合物中释放的锌在进入十二指肠时可被肌醇六磷酸竞争性结合，从而降低生物可接近性[36]。肽锌螯合物的稳定性受到pH的影响，这是因为大多数肽配体（包括末端氨基和羧酸根阴离子、Asp、Glu和His）响应pH变化，导致其金属配合物的缔合或解离。这些配体在中性碱性pH下去质子化，然后增加与金属离子的静电吸引力从而加强复合体[37]。相反，酸性环境会导致这些残留物的质子化，并且往往会削弱吸引力。因此，肽锌螯合物很可能在胃的酸性pH下解离，如果最终形成不溶性复合物，最终会导致金属难以接近。如之前的一项研究报导牦牛酪蛋白肽锌螯合物在pH 2.0下比在微酸性或碱性pH下释放更多锌离子[6]。肽的结构性质可以影响其金属络合物的稳定性。肽与金属离子相互作用的能力可取决于它们的净表面电荷，使得高负电荷可增强金属离子亲和力并增强金属络合物[38]。Wang等[39]使用两阶段体外消化模型研究3种肽（Ser-Met、Asn-Cys-Ser、谷胱甘肽）及其锌-肽复合物的降解特征。在该研究中检测酶抗性肽和锌-肽螯合物、抗氧化活性和消化酶释放的游离氨基酸。结果显示，这3种肽及其锌-肽复合物对胃蛋白酶具有抗性，但对胰酶不具有抗性。胰酶可部分水解肽和锌-肽复合物，但其中1/2以上在胃肠道消化后保持其原始形式。由于螯合物的溶解度较低并且影响胃蛋白酶和胰酶的水解位点，锌的配位改善肽的酶抗性。锌-Asn-Cys-Ser对酶水解具有高度抗性并且以可溶形式保持锌离子，可能具有提高锌的生物利用度的潜力。

3 结语与展望

天然蛋白源制得的肽锌螯合物除了可以作为补锌剂外，还能以抗氧化剂、抑菌剂、有机肥料、动物饲料等产品应用到工业生产，较一些无机抗氧化剂、抑菌剂或锌离子补充剂而言，具有更优良的生物学效价，几乎无不良毒副作用，具有很高的商业价值[40]。关于锌螯合肽的分离纯化及构效关系的分析国内外已有诸多报道，但仍有部分问题尚待解决，如锌离子与肽的螯合率、锌螯合肽在人体内的生物利用度等的提高问题，以及锌螯合肽与锌离子作用的具体构效关系等仍需要进一步揭示。另外，寻找和鉴定其他天然的新型锌螯合肽也将会是一个十分有意义的挑战。肽锌螯合物作为一种新型锌离子螯合物，因其特殊的生物活性属性和在食用药用等方面的优势使其有十分广阔的研究和应用前景。

对肽锌螯合物近年来的研究发展进行了总结，肽锌螯合物作为一种新型锌离子螯合物，其特殊的生物活性属性和在食用药用等方面的优势使其有十分广阔的研究和应用前景。