基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品的制备

王国强，马红芳，曾华辉，贾 媛，苏运芳，毛梦迪，刘保光，尚立芝*，张振强*

(1.河南中医药大学中医药科学院，河南 郑州 450046；2.河南省农业科学院，河南 郑州 450002；3.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046；4.河南中医药大学基础医学院，河南 郑州 450046)

【研究意义】猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)，由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起仔猪和育肥猪的一种以呕吐和水样腹泻为特征的高度接触性肠道传染病，其可感染各年龄段的猪，导致较高的发病率和死亡率，3 日龄以内的哺乳仔猪感染后死亡率最高可达100 %，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemmagglutinatipg Encephalomyelitis Virus，PHEV) 及猪丁型冠状病毒(Porcine Deltacorona Virus，PDCo V)极为相似[1]。该病于1971年在英格兰首次被发现和报道，在比利时流行期间被确认其病原为PEDV[2-4]。PEDV属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的Ⅰ型成员，其基因组为约28 kb大小的单链正义RNA，可编码4个结构蛋白(S，E，M和N)和非结构蛋白(1a，1ab和ORF3)[5]。从2010年下半年开始，我国全国范围内爆发PEDV，给我国养猪业造成了严重的经济损失。在形态学、临床变化和症状上，PEDV和TGEV、PHEV以及PDCo V极为相似，又很难做到鉴别区分。因此，实验室快速、准确诊断PEDV对防控尤为重要，逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)可以用来检测组织和粪便的病料，其便捷、快速、准确，灵敏性高、特异性强、重复性好等特点，成为PEDV检测的首选。【前人研究进展】自1990年代初以来，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)被广泛用作诊断工具，改变了微生物诊断方法，尤其是RT-PCR的使用彻底改变了RNA病毒的诊断检测方法，可对各种样品中的RNA进行快速，特异和灵敏的检测。随着RT-PCR分子诊断技术的迅猛发展，拥有出色的质量控制或标准对于确保精确和排除不正确的结果显得尤其重要，对具有特异性强、稳定性好、以及可以全程监控整个检测过程的质控品的需求日益增长，要求越来越高。相较于仅感染人或者人畜共患的病毒核酸标准物质，仅感染动物的病毒类核酸标准物质研究明显滞后[6]。用来作为RNA病毒检测的质控品目前主要有三类，一是全病毒颗粒(活病毒、灭活病毒或阳性动物病料血清或组织)，其虽可以全程监控病毒核酸裂解、提取和扩增检测的全过程，但成本高，稀缺阳性材料难以大量获取，存在生物安全等问题[7]；二是裸露的RNA，其制备简单，可以精确定值，安全性好，但是环境中到处都是RNase，极易降解；三是包封目标RNA的假病毒颗粒，其在形态和结构上与天然病毒类似，但不具有感染性，高度稳定，可实现RNA病毒核酸检测的全程监控，是一种理想的质控品[8]。MS2噬菌体具有在体外利用自身基因组中成熟酶蛋白基因(A)、衣壳蛋白基因(CP)和包装位点基因(PAC)，将插入其下游的外源RNA 的cDNA序列组装形成病毒样颗粒(Virus-like Particle, VLPs)，也被称为装甲RNA(Armored RNA)[9-10]。通过基因工程手段构建含MS2外壳蛋白基因、PAC位点基因以及外源待测核酸序列的原核表达载体，很容易在大肠杆菌中大量表达，在体外形成包封待测RNA的VLPs作为质控品。【本研究切入点】本研究选取PEDV基因组中保守的N蛋白基因(155 bp)作为靶检测序列，采用分子克隆方法将该保守序列插入原核载体pET28a/CP(前期构建，包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因和PAC位点基因)，构建重组质粒pET28a/CP/PEDV，重组质粒在大肠杆菌诱导表达，纯化，得到了CP 蛋白，其经过透射电镜进行物理表征，显示在体外自组装形成了VLPs。纯化的VLPs用核酸酶充分消化残留的DNA和RNA后，提取RNA，通过荧光定量PCR检测，证明VLPs包封了外源的PEDV靶序列，形成了盔甲RNA。盔甲RNA耐RNase，具有良好的稳定性。【拟解决的关键问题】制备的盔甲RNA可以作为PEDV RT-PCR检测的质控品，其安全无污染，可以做到从核酸提取到扩增检测的全程监控，为PEDV的准确快速诊断和防控提供支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株、重组质粒和主要试剂 克隆菌株DH5α，表达菌株BL(DE3)，重组质粒pET28a(+)/CP(包含噬菌体MS2衣壳蛋白CP基因和PAC位点基因)为本实验室前期构建和保存；限制性内切酶BamH I-HF和HindΙΙΙ-HF、T4 DNA连接酶购自NEB(北京)，Protein Marker购自北京索莱宝科技有限公司；RNAiso Plus核酸提取试剂、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)反转录试剂、Probe qPCR Mix荧光探针PCR检测试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Benzonase核酸酶购自Sigma公司；氯仿，异丙醇等其它化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 引物 根据NCBI上PEDV/MEX/MICH/01/2013株(GenBank:MH006957.1)，选取N蛋白基因保守区序列，通过引物设计软件Primer Premier 5和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/设计引物和探针序列，探针5’用荧光报告基团FAM修饰，3’用淬灭基团BHQ1修饰，上游和下游引物分别加上BamH I和HindΙΙΙ酶切位点。引物和探针序列见表1，引物、探针和pUC57载体(携带有PEDV N蛋白基因中155 bp靶序列)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和构建。

表1 RT-PCR中用到的引物和探针序列

1.2 试验方法

1.2.1 重组载体构建 以pUC57为模板，PEDV-F和PEDV-R为引物，扩增PEDV N蛋白基因靶序列。用BamHⅠ和HindΙΙΙ 分别双酶切质粒pET28a(+)/CP(携带有MS2噬菌体外壳蛋白CP基因和PAC位点基因)和PCR扩增的N蛋白基因靶序列，回收、连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。提取质粒，通过双酶切和测序进行鉴定，结果正确的重组质粒命为pET28a(+)/CP-PEDV(表1)。

1.2.2 重组蛋白的表达与纯化 测序正确的重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV转化大肠杆菌表达菌株BL(DE3)感受态细胞，37 ℃培养至OD600 nm值为0.5～0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1 mM，18 ℃振荡诱导表达20 h。用0.01M PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心收集上清。上清加入30 %的饱和硫酸铵，4 ℃搅拌30 min，离心收集沉淀，PBS重悬沉淀后用2 L PBS缓冲液搅拌透析除去硫酸铵。透析后样品过滤后用Sephacryl s-1000凝胶过滤层析柱纯化。

1.2.3 纯化蛋白的物理表征 硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析纯化的目的蛋白，在2 %磷钨酸复染，100 kV 加速电压条件下，通过JEM-1400(日本)透射电子显微镜，观察颗粒粒径和均一度。

1.2.4 病毒样颗粒核酸酶消化和残余核酸检测 0.01M PB缓冲液透析凝胶过滤层析纯化的病毒样颗粒，取1 mL透析后得病毒样颗粒加入终浓度为2 mM的Mg2+，同时加入300 U的Benzonase全能核酸酶，在37 ℃条件下消化8 h。取消化后的病毒样颗粒100 μl，用RNAiso Plus裂解提取RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)说明书反转录得到CDNA。用Probe qPCR Mix荧光探针PCR检测试剂检测Benzonase核酸酶消化后病毒样颗粒和病毒样颗粒裂解反转录的CDNA。

1.2.5 荧光定量PCR标准曲线建立和病毒样颗粒核酸拷贝数确定 用NanoDrop2000超微量分光光度计测量重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV的浓度，按照公式：样品Copies/μl = 阿伏伽德罗常数(6.02×1023)拷贝数×浓度(ng/μl×10-9)/重组质粒平均分子量(DNA length×660)，计算重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV原始拷贝数。对重组质粒进行10倍系列稀释，然后分别以各个稀释度为模板，建立标准曲线。同时，用标准曲线检测以Benzonase核酸酶消化后病毒样颗粒裂解反转录的CDNA，确定病毒样颗粒核酸拷贝数。

1.2.6 病毒样颗粒耐核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)攻击检测 将600 μl Benzonase核酸酶消化后的病毒样颗粒，分为2组，每组3份，每份100 μl。其中一组(3份)直接进行裂解和反转录，另一组(3份)在样品裂解前加入10 μl 1mg/L的RNase，37 ℃条件下放置60 min后，再进行裂解和反转录。最后，2份CDNA进行 PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，比较检测结果。

1.2.7 病毒样颗粒稳定性检测 取2 mL Benzonase核酸酶消化后的病毒样颗粒，用0.22 μm针头滤器无菌过滤，分为4份，每份500 μl。1份4 ℃放置，剩余3份37 ℃分别放置5、10、15 和20 d，然后进行样品裂解、反转录和荧光定量PCR检测，比较其Ct值变化。

2 结果与分析

2.1 载体构建和目的蛋白的表达、纯化

PCR扩增的PEDV N蛋白基因靶序列，通过双酶切插入到质粒pET28a(+)/CP中MS2噬菌体CP基因和PAC位点基因的下游，双酶切和测序结果均正确。重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV在大肠杆菌表达菌株中诱导表达，目的蛋白经过硫酸铵和分子筛进行纯化，SDS-PAGE显示纯度达85 %以上(图1-b)。

a：箭头所指为目的蛋白峰；b：M，蛋白分子量标准；1：超声破碎后上清；2：硫酸铵沉淀后重悬上清；3：凝胶过滤层析第一个流出峰浓缩后 a: The peak pointed by the arrow is the target protein; b: M, protein marker; Lane 1: Supernatant after sonication; Lane 2: Resuspension after precipitation of ammonium sulfate; Lane 3: The first peak of gel filtration chromatography

2.2 透射电镜观察病毒样颗粒

纯化的目的蛋白经磷钨酸染色，通过透射电镜(150 000×)进行观察，目的蛋白在体外自组装形成了大小均一，直径约为23～28 nm的病毒样颗粒(图2)，符合MS2噬菌体直径大小。

图2 电镜观察病毒样颗粒(盔甲RNA)的形状及粒径 Fig.2 Observation of the shape and size of virus-like particles (Armor RNA) by electron microscope

2.3 病毒样颗粒核酸酶消化和残余核酸检测

为了完全除去纯化的病毒样颗粒含有的残余核酸(重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV和大肠杆菌基因组)对后续实验造成的影响，纯化的VLPs经Benzonase核酸酶消化，消化后通过荧光定量PCR检测，结果显示消化后样品直接PCR，Ct值为38.76，说明残余重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV已被彻底消化；而消化后的样品，经过裂解和RT-PCR检测，Ct值为11.13，表明形成的VLPs包封了N蛋白基因靶序列，即形成盔甲RNA(图3)。

图3 核酸酶消化后病毒样颗粒残余核酸检测Fig.3 Detection of residual nucleic acid of virus-like particles after nuclease digestion

2.4 病毒样颗粒核酸拷贝数确定

通过公式计算重组质粒pET28a(+)/CP-PEDV的浓度为1.5×107copies/μl，重组质粒10倍系列稀释后，选取10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀释度建

立标准曲线，以质粒系列稀释度为横坐标，PCR扩增的阈循环数(threshold cycle, Ct)为纵坐标建立标准曲线(图4)，其回归方程为Y= -3.315X+42.424，斜率为-3.315，相关系数R2= 0.998，表明PCR扩增效率高，标准曲线线性良好，样品浓度对数值与阈循环数之间具有良好的相关性。病毒样颗粒稀释100倍后荧光定量PCR检测，其Ct值为17.52，通过标准曲线计算，病毒样颗粒拷贝数为2.4×106copies/μl。

a：扩增曲线；b：标准曲线 a: Amplification curve; b: Standard curve

2.5 病毒样颗粒耐RNase攻击实验

用RNase处理VLPs后与未处理对照组，平行进行样品裂解、RNA提取、RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：RNase处理前后，目的条带亮度基本一致(图5)，说明制备的病毒样颗粒能够抵抗RNase的降解作用。

M：核酸分子量标准；1、2、3：RNase未处理；4、5、6：RNase 37 ℃处理60 minM: Nucleic acid molecular weight standard; 1, 2, 3: RNase untreated; 4, 5, 6: RNase treated at 37 ℃ for 60 min

2.6 病毒样颗粒的稳定性实验

过滤除菌的病毒样颗粒在37 ℃条件下放置5、10和15 d，RT-PCR检测其Ct值和4 ℃基本一致，没有差异，37 ℃条件下放置20 d的Ct值升高(图6)，从Ct值变化趋势可看出，制备的盔甲RNA在37 ℃条件下至少可以储存15 d，具有良好的热稳定性。

图6 病毒样颗粒(盔甲RNA)的热稳定性检测 Fig.6 Detection of thermal stability of virus-like particles (Armor RNA)

3 讨 论

PEDV是目前危害养猪业最重要的病原体之一，其主要危害仔猪(3～10 日龄)，导致仔猪严重水样腹泻和脱水死亡，部分地区的猪场仔猪腹泻样品中PEDV核酸检出率甚至高达80 % 以上[11]，快速准确的诊断对PEDV的防控有重要意义。相较于常规的病原学检测、血清学检测以及病原的快速检测(免疫胶体金层析)等方法，以核酸扩增为基础的分子检测技术，因其具有灵敏度高、特异性强、快速高效、定量准确和高通量等优点，在动物疾病诊断中发挥了巨大作用[12]。环介导等温扩增[13]、巢氏PCR技术[14]、多重PCR技术[15]、SYBR Green I 荧光定量PCR[16]、TaqMan荧光定量PCR[17]等核酸检测方法均用于PEDV的快速检测，效果良好。PEDV基因组中的M基因和N基因保守性非常强，常作为PEDV诊断的候选基因，但不能区分经典毒株和变异毒株[11]；致弱毒株的ORF3基因有51个碱基缺失，并且造成病毒毒力减弱，可以作为鉴别强弱毒株的依据[18]，S 基因是PEDV 毒株毒力和进化的特征性基因，之前也有学者报道了通过S基因区分变异毒株的RT-PCR 方法[19-20]。

虽然病毒核酸扩增检测成为新发再发病毒类疾病快速准确诊断的有效方法，但影响试验过程的因素太多：核酸扩增过程本身的高灵敏度，些许的气溶胶就会导致假阳性无法控制；实验操作人员的操作失误或随机误差；核酸提取抑制物的残留；仪器控温不精确和空间的差异；引物和探针设计的不合理；逆转录和扩增效率差；试剂良莠不齐等，这些都会造成最终结果的偏差，甚至结果不可使用[21]。因此，核酸扩增检测特别是RNA病毒的核酸扩增检测，必须使用质控品，对检测的全过程进行严格的质量控制才能保证结果的可靠性。能做到稳定可靠、全过程监控(核酸提取、反转录和扩增分析)、安全无生物危害、易于制备的VLPs(盔甲RNA)无疑是理想的质控品[22]。利用MS2噬菌体外壳蛋白在体外可以将PAC位点下游的核酸包封成VLPs，HCV、HEV、HIV、EV71、流感病毒以及马动脉炎病毒等多种RNA病毒质控品都已成功制备[21]。

本实验选取PEDV基因组中保守性强的N蛋白基因作为靶基因，插入到含有MS2噬菌体外壳蛋白基因和PAC位点基因下游，构建重组载体，通过原核表达系统，在体外成功得到了包封靶基因的盔甲RNA。在本研究构建重组载体过程中，将MS2噬菌体外壳蛋白CP基因和PAC位点基因插入原核载体，构建重组质粒和工程菌株。该工程菌株在低温诱导条件下，电镜观察和荧光RT-PCR检测，外壳蛋白自组装且包封靶序列形成了盔甲RNA。为了消除纯化的VLPs残余的大肠杆菌基因组以及重组质粒核酸，实验前期使用了DNase I和RNase 37 ℃进行消化，但是效果并不理想，仍有残余的重组质粒，后期使用Benzonase全能核酸酶，可以很好消除残余核酸影响。本研究获得的盔甲RNA可以抵抗一定RNase的降解，无菌过滤后，在37 ℃条件下可以稳定保存15 d，是一个理想的RT-PCR质控品，可为PEDV的快速准确检测提供技术支持。

4 结 论

MS2噬菌体外壳蛋白可以在体外包封外源RNA(PEDV N蛋白基因靶序列)，并形成热稳定性好，耐Rnase攻击的病毒样颗粒(盔甲RNA)，该盔甲RNA可从RNA提取、反转录到扩增检测全程进行监控，可作为RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的质控品，从而保证检测结果的正确性。其制备方法具有通用性，可为其它RNA病毒核酸检测质控品的制备提供参考。