不同年龄不孕患者卵泡液游离DNA和血管内皮生长因子含量对胚胎发育潜力的影响分析

何正枝 林 冰 甄锦壮 严红莲

广东医科大学顺德妇女儿童医院 （佛山市顺德区妇幼保健院）生殖科，广东佛山528300

体外受精-胚胎移植（IVF-ET）中选择整倍性胚胎移植后即使植入成功也并非都能获得持续妊娠，表明胚胎发育潜力也不能仅通过染色体的状态来评估[1]，应继续探讨新的预测评估胚胎发育潜力指标，提早进行干预治疗将能改善胚胎结局。本研究通过检测2018年12月～2020年4月共94例周期患者卵泡液游离DNA（cfDNA）、血管内皮生长因子（VEGF）含量与胚胎发育质量的关系，探讨其在预测胚胎发育潜力的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年12月～2020年4月在本院接受辅助生殖技术助孕的94例周期患者，纳入标准：（1）辅助生殖技术助孕适应证为输卵梗阻/缺如；（2）在研究期间行常规IVF-ET患者的第一个周期。排除标准：（1）男方取卵日因精液质量下降严重、睾丸取精、受精低下等行卵泡浆内单精子注射技术；（2）取卵日未获得卵母细胞；（3）女方有可能影响卵子质量的基础疾病。共纳入94例周期患者，年龄23～44岁，按照年龄分组,年龄≥35岁的患者为研究组（n=44），年龄＜35岁的患者为对照组（n=50）。女性患者卵巢储备功能基本处于正常范围，男方精液基本正常。本研究通过本院医学伦理委员会批准，且与患者签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 卵泡液收集 取卵日手术医生对直径＞17mm的卵泡优先进行穿刺，将取得的第一管颜色清亮的卵泡液传递到胚胎实验室。捡取卵丘冠复合物后将卵泡液以3000r/min、10min离心，留取上清液，-80℃保存待检。

1.2.2 卵泡液cfDNA检测 购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司的EXKubit dsDNA HS分析试剂盒，使用Qubit3.0荧光检测仪按照操作说明书进行检测，记录数据。

1.2.3 卵泡液VEGF检测 购自武汉博士德Human VEGF PicoKine ELISA Kit试剂盒，HR801酶标仪读取吸光度，根据标准品得出的曲线进行数值计算。

1.2.4 胚胎质量参数收集

1.2.4.1 受精卵观察 参照 Nasiri[2]的分级法：根据卵胞质内原核数量、合子中核的位置、大小、排列及核内核仁的数目、大小、分布情况对受精卵进行评估，依评估结果将正常受精卵分为 Z1、Z2、Z3、Z4 四个等级。

1.2.4.2 卵裂期胚胎评分 参照日内瓦胚胎评分标准：根据卵裂球的数目、均匀程度、形成碎片的多少评分。

1.2.4.3 囊胚评分 参照Gardner囊胚分级法：首先根据囊腔的扩张程度将其分为6期，1期：囊胚腔＜囊胚体积的1/2；2期：囊胚腔＞囊胚体积的1/2；3期：囊胚腔充满整个囊胚； 4期：透明带变薄，囊胚腔扩张；5期：正在孵出的囊胚；6 期：完全孵出的囊胚。内细胞团分为3个级别，A级：细胞数多，细胞结合紧密；B级：细胞数较少，细胞结合较松散；C 级：细胞数极少。滋养层细胞也分为3个级别，A 级：细胞数目多，囊胚四周均有细胞分布；B 级：细胞数目较少，上皮细胞较松散；C 级：细胞数目极少。

正常受精率=2PN/获卵数×100%、可利用胚胎率=可利用胚胎数/卵裂数×100%、卵裂期优质胚胎率=卵裂期优质胚胎数/卵裂数×100%、继续培养囊胚形成率=形成囊胚数/继培胚胎数×100%、优质囊胚率=优质囊胚数/继培胚胎数×100%。

可利用胚胎定义：培养到第三天时用于移植、冷冻及胚胎继续培养发育达到优质囊胚标准的数目总和；卵裂期优质胚胎定义为：第一天原核评分为2PN、Z1或2PN、Z2；第二天卵裂球数为4～5个，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；第三天卵裂球数为7～9个，卵裂球均一（E）或部分不均（U），碎片0%～15%；优质囊胚率定义：根据囊胚腔的扩张程度、内细胞团大小及外滋养层细胞数量，评分达到3BC/3CB及以上的囊胚。

1.3 胚胎的观察时间

1.3.1 卵母细胞采集 采用常规促排卵方案，卵泡生长成熟充分时，于注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）后36～38h在阴道B超介导下穿刺取卵，在体式显微镜下从卵泡液中捡取卵丘冠复合物后转移到二氧化碳培养箱中培养2～4h。

1.3.2 体外授精 把优化处理后的精液按照一定的比例加入到培养皿中进行授精操作，于授精后4h拆除卵母细胞周围的颗粒细胞观察第二机体出现率，如果大于30%则为受精成功。

1.3.3 胚胎及囊胚的观察 受精后的第一天记录受精卵的原核情况，第2、3天记录分裂期胚胎情况，培养到第3天将需要行囊胚培养的卵裂期胚胎转移到专用的囊胚培养液中继续培养2～4d，记录囊胚形成情况。

1.4 统计学分析

应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以（） 表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

两组间体重指数（BMI）、促性腺激素（Gn）使用时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），不孕年限比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 两组卵泡液cfDNA、VEGF含量比较

研究组患者cfDNA含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），研究组患者VEGF含量比对照组有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 两组患者一般资料比较（±s）

表1 两组患者一般资料比较（±s）

组别 BMI（kg/m2）Gn使用时间（d）不孕年限（年）研究组（n=44） 22.39±3.47 11.68±2.44 4.48±3.94对照组（n=50） 21.34±3.01 12.34±3.35 3.14±2.22 t 1.571 1.079 2.062 P 0.104 0.332 0.032

表2 两组患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比较（±s，pg/mL）

表2 两组患者卵泡液cfDNA、VEGF含量比较（±s，pg/mL）

组别 cfDNA VEGF研究组（n=44） 27.96±4.43 761.45±436.79对照组（n=50） 22.14±3.35 671.33±417.22 t 7.225 1.022 P 0.001 0.309

2.3 两组患者胚胎发育参数比较

研究组的继续培养囊胚形成率及优质囊胚率明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组正常受精率、可利用胚胎率、卵裂期优质胚胎率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 两组患者胚胎发育参数比较 [%（n/n）]

3 讨论

外周血cfDNA主要来源于细胞的凋亡及坏死，以双链DNA、DNA蛋白质复合物等形式存在于血液中，大小为150～210000bp不等的片段。1948年Mandel[3]首次在健康人外周血中发现了游离DNA的存在，由于健康人群自身机体平衡机制的作用使其含量维持在较低水平。1997年Lo等[4]首次证实孕妇血浆（清）中存在游离胎儿DNA并将其应用于性连锁遗传病中，为产前诊断开辟了无创产前诊断新途径，随后在人体其他体液如精液、尿液、脑脊液、卵泡液及囊胚液中均检测到cfDNA的存在[5]。Thierry等[6]研究发现血浆cfDNA与肿瘤组织DNA的测序达96%以上一致，由于肿瘤的异质性使其在肿瘤细胞穿刺过程或组织活检中可能只检测到部分的亚型，而血浆cfDNA则能全面地检测分析出肿瘤的分子亚型。在IVF-ET中卵子质量包括卵子完成正常减数分裂、受精、胚胎生成以及后续发育的能力，是胚胎发育潜能的决定因素，也是影响助孕结局的主导因素[7]。卵母细胞在发育成熟的过程中所需的营养物质均来自于卵泡液，所产生的代谢产物也排泄入卵泡液中[8]。国内外有报道关于辅助生殖患者血清及卵泡液中各成分的变化对临床结局的影响，但缺乏对卵泡液中cfDNA和VEGF含量检测对不同年龄不孕患者胚胎发育潜力预测分析的报道。本研究中卵泡液cfDNA含量在卵裂期胚胎发育中未产生明显影响，但在发育到囊胚阶段就产生较大的影响，并随着年龄的增长，卵泡液cfDNA含量增加而囊胚形成的数量及质量明显下降，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。卵泡液中cfDNA可能是卵母细胞在发育成熟过程中遇到应激反应或自身新陈代谢异常的产物释放到卵泡液中，能反映卵子质量高低的指标之一，在胚胎培养体系中获得高质量的卵子是培养出优质胚胎的前提条件，给患者带来更实际性的帮助。卵母细胞是在充满卵泡液的微环境中发育和成熟，研究卵泡液微环境中各种物质及细胞因子的改变对卵子质量的影响及卵泡发育的调节机制，为了使胚胎体外培养体系更加接近机体的生理环境，获得理想的妊娠结局。取卵过程中B超显示卵泡的直径不一定与卵子的成熟度相关，凭主观上的卵泡直径大小并不能明确说明卵子的成熟度及质量高低，如何能快速准确反映卵母细胞成熟度及卵子质量，对预测胚胎发育潜力显得尤为重要，也将成为辅助生殖技术探索的新方向。王兴玲等[9]研究表明cfDNA在预测卵母细胞成熟度和胚胎质量方面的应用有很大价值，研究结果显示游离DNA含量与卵母细胞质量及胚胎质量有相关性，使用脱氧核糖核酸酶来降低cfDNA含量的靶向治疗将会成为治疗不孕患者的高效技术之一。

VEGF是肝素结合双链糖蛋白，在血管生成、血管通透性、细胞增殖等方面起着重要作用。曹娟等[10]研究表明，VEGF刺激血管内皮细胞数目增多而加速血管的形成，诱导内皮细胞产生蛋白水解酶、组织因子及间质胶原酶等改变血管通透性，加快纤维蛋白原及血浆蛋白的外渗导致间质水肿、损伤细胞外基质，在肿瘤细胞的生长浸润以及转移过程中发挥重要作用。也有研究[11]表明，VEGF参与糖尿病血管并发症的发生发展全过程。卵泡液中VEGF能够促进卵泡周围微血管形成，使卵泡从血液中获得营养物质，为卵泡的发育、卵母细胞的成熟、胚胎的着床提供良好的局部环境[12]。Konc等[13]研究表明，在卵泡生长发育过程中，颗粒细胞上和卵泡膜细胞上的VEGF表达强度随着卵泡生长发育而增强，排卵前VEGF升高可能反映了颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖和成熟，提示卵泡成熟。目前评价胚胎质量的优劣程度主要参照胚胎发育形态学规律，建议在观察胚胎形态学变化的基础上测定卵泡液中VEGF含量，采取有效的措施降低劣胚形成率。有研究进一步表明在卵泡液中加入适量的VEGF而人为改变卵子成长发育微环境，有助于提高胚胎质量并提高助孕成功率[14]。本研究中卵泡液VEGF含量在两组间差异无统计学意义（P＞0.05），可能与所纳入例数有关但研究组卵泡液VEGF含量稍高于对照组，研究组的卵裂期胚胎质量和对照组相当，但研究组的囊胚形成率和优质囊胚率比对照组差，说明卵泡液VEGF促进卵泡周围微血管生成，血管通透性增加从而使卵泡液中含有更多的卵泡刺激素、黄体生成素和其他营养物质作用于卵巢颗粒细胞及卵泡膜细胞，从而诱导卵母细胞成熟过度。有研究发现[15]卵泡液中低VEGF水平的优质胚胎具有高种植能力而高VEGF含量则预示胚胎发育不良。本研究中卵泡液VEGF含量与胚胎发育潜力是否有相关性还需进一步研究。

胚胎发育是一个动态变化的过程，仅从卵裂期胚胎的传统形态学评分来判断其发育潜力还不完全准确，囊胚培养是衡量体外胚胎发育潜力的有效方法[16]。根据本研究结果推测，卵泡液cfDNA含量对胚胎发育过程中囊胚的形成及质量有着一定的影响，对不同年龄不孕患者胚胎发育潜力有预测价值；卵泡液VEGF含量随着年龄的增长有所升高，但在两组不同年龄患者中的差异无统计学意义，对胚胎发育质量没有明显的影响。目前对cfDNA、VEGF的检测可能受到标本来源和处理办法、实验操作及灵敏度等问题，还需要建立标准化的临床检测流程。研究组的促性腺激素总量比对照组大，可能与患者年龄增大对药物的反应性降低有关。为了能更深入探讨卵泡液中cfDNA、VEGF含量对胚胎发育潜力评估，还需要大样本的研究来论证。