猴头菇液体培养基的筛选和优化

李卫卫 马 红 尹永刚

（北京祥云兴隆农业科技发展有限公司，北京102211）

猴头菇（Hericium erinaceus），以似猴头的形状而得名，是一种著名的药食两用菌，具有极高的营养价值和药用价值[1～3]。传统的猴头菇生产采用固体二级种或枝条种，存在制种周期长，人工成本高，工艺复杂等问题[4]。随着猴头菇工厂化生产的出现和发展，制种周期短、操作简便、易于机械接种的液体菌种开始被广泛应用[5]。研究表明，液体发酵产生的菌丝体营养成分与子实体相差不多，甚至有些菌种的菌丝体微量元素含量高于子实体[6]。研究以工厂化猴头菇菌株（XYH-1）为对象，采用正交试验进行液体发酵培养基的优化，找出较为经济适用的液体培养基的碳源和氮源，测定不同液体培养基对菌丝体干重的影响，以及不同玉米粉添加量和不同糖添加量对发酵菌丝生物量的影响，为猴头菇液体菌种发酵培养和生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

使用菌种来自北京祥云兴隆农业科技发展有限公司。

1.2 培养基配方

猴头菇菌种活化采用PDA 培养基：葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，土豆汁200 mL，水1 000 mL，pH自然[7]。试管和平板菌种培养也用此培养基。碳源筛选基础培养基：蛋白胨0.3%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH5.6。氮源筛选基础培养基：白砂糖2.0%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH5.6。

1.3 菌种活化培养基制备

用接种针挑取供试菌株母种接种块，接种于PDA 试管斜面的中间，接种块大小0.2×0.2×0.2（cm），25℃下培养10天。以复壮试管为母种接种于PDA平板的中间，接种块大小0.3×0.3×0.2（cm），25℃下培养10天，摇瓶使用。

1.4 仪器设备

YXQ-L375S11 型立式压力蒸汽灭菌器、博讯电热鼓风干燥箱、美的电磁炉、净化工作台（100级）、HYG-A 全温摇瓶柜、SH-250 生化培养箱等。

1.5 液体培养菌丝烘干测重方法

先称好平板和纱布的重量，再用纱布过滤培养结束的猴头菇培养液，将上清液用纯化水冲洗2～3 遍，把纱布和菌丝体放在平板上，一起送入电热鼓风干燥箱内于80℃烘干，称重。另称取相同重量的纱布烘干后计算其失水重量。以烘干后总重量减去平板和纱布的重量，再加上纱布失水重量，计算获得菌丝体干重，即菌丝生物量。

1.6 猴头菇液体培养基的碳源筛选

设5 组试验，分别将2.0%葡萄糖、2.0%白砂糖、2.0%甘薯粉（自制）、2.0%玉米粉、2.0%乳糖等5种碳源添加至碳源筛选基础培养基中，分装于500 mL 三角瓶中，每瓶分装200 mL，每组试验设3个重复。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min冷却至室温后，用0.6 cm 打孔器对平板打孔，每瓶接种4个接种块，于24.5℃150 r/min 摇床培养8天，测量菌丝体干重。

。

1.7 猴头菇液体培养基的氮源筛选

设4 组试验，分别将0.3%豆粕粉、0.3%麸皮粉、0.3%蛋白胨、0.3%酵母粉等4种氮源添加至氮源筛选基础培养基中，分装于500 mL 锥形瓶中，每瓶分装200 mL，每组设3个重复。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min。冷却至室温后，用0.6 cm 打孔器对平板打孔，每瓶接种4个接种块，于24.5℃150 r/min 摇床培养8天，测量菌丝体干重。

，

1.8 液体培养基中玉米粉的添加量试验

设5 组试验，以1.6%白砂糖、0.3%蛋白胨、0.1%KH2PO4为基础培养基，添加0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%等5 档玉米粉含量，分装于500 mL 锥形瓶中，每瓶分装200 mL，每组设3个重复。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min。冷却至室温后，用0.6 cm 打孔器对平板打孔，每瓶接种4个接种块，于24.5℃150 r/min 摇床培养8天，测量菌丝体干重。、

1.9 液体培养基中糖的添加量试验

设4 组试验，以0.3%玉米粉、0.3%蛋白胨、0.1%KH2PO4为基础培养基，添加0.8%、1.6%、2.4%、3.2%等4 档白砂糖含量，分装于500 mL 三角瓶中，每瓶分装200 mL，每组设3个重复。使用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min。冷却至室温后，用0.6 cm 打孔器对平板打孔，每瓶接种4个接种块，于24.5℃150 r/min 摇床培养8天，测量菌丝干重。

1.10 猴头菇液体培养基的配方优化

使用筛选的3种碳源、3种氮源，以及无机盐、维生素进行正交试验（表1），共9 组试验，每组试验设3个重复。使用500 mL 三角瓶，每瓶分装200 mL，采用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30 min，冷却后，每瓶接种4个接种块，于24.5℃150 r/min摇床培养8天，测量菌丝干重。

表1 液体培养基试验因素与水平正交设计

2 结果与分析

2.1 不同碳源的菌丝生物量

由图1可知，猴头菇菌丝能够分解多种碳源，在基础培养基中添加2.0%玉米粉的菌丝生物量最高，为4.7 mg/mL，与其他组存在显著性差异；添加甘薯粉的菌丝生物量次之，为2.3 mg/mL，与其他组存在显著性差异；再次为白砂糖，菌丝生物量为0.3 mg/mL，与葡萄糖和乳糖之间无显著性差异。表明玉米粉和甘薯粉是猴头菇液体发酵的适宜碳源。

图1 不同碳源液体培养基的猴头菇菌丝生物量比较

2.2 不同氮源的菌丝生物量

由图2可知，酵母粉较有利于猴头菇菌丝生物量的增加，试验产生的菌丝生物量为3.5 mg/mL；麸皮粉次之，为2.5 mg/mL；豆粕粉位居第三，为2.0 mg/mL。差异显著性分析的结果，蛋白胨组的菌丝生物量较低，与酵母、麸皮、豆粕各组之间存在显著差异。因此，麸皮粉、酵母粉和豆粕粉是猴头菇菌丝的良好氮源。

图2 不同氮源液体培养基的猴头菇菌丝生物量比较

2.3 不同玉米粉添加量的菌丝生物量

菌丝量随玉米粉添加量的增加而增加（图3）。其中，1.6%添加量的菌丝生物量最高，为7.9 mg/mL；0.8%添加量次之，为7.1 mg/mL；0.4%和0.2%添加量分别为4.3 mg/mL和3.9 mg/mL；不加玉米粉的最差，仅为0.1 mg/mL，添加0.2%玉米粉是未添加的39 倍。

通过观察，玉米粉添加量为1.6%的摇瓶培养液通透性较差，推测玉米粉含量过高较易糊化。因此建议玉米粉添加量不要超过3%。试验中采用白砂糖、葡萄糖、乳糖的通透性虽高，但获得菌丝体很少；甘薯粉和玉米粉通透性虽差但菌丝量高，推测因菌丝体的培养需要附着物，玉米粉和甘薯粉140 目为颗粒物，能起到这种作用。试验表明，在1.6%的添加量范围内，玉米粉添加量与菌丝生物量呈正相关关系。

图3 不同玉米粉添加量的猴头菇菌丝生物量比较

2.4 不同白砂糖添加量的菌丝生物量

由图4可见，菌丝量随白砂糖含量增加而增多。添加3.2%的白砂糖，菌丝生物量最高，达7.5 mg/mL，与其他添加量之间存在显著差异；2.4%和1.6%添加量，分别为4.8 mg/mL和4.4 mg/mL，差异不显著；0.8%添加量的菌丝生物量最低，为3.3 mg/mL。说明在相同条件下在3.2%添加量范围内，白砂糖添加量与菌丝生物量呈正相关关系。

图4 不同白砂糖添加量的猴头菇菌丝生物量比较

2.4 猴头菇液体培养基的优化

正交试验的结果与猴头菇液体培养的菌丝体干重见表2。极差R 结果反映4个影响因子顺序依次为A 碳源>B 氮源>C 无机盐>D 维生素。说明碳源和氮源是影响猴头菇液体发酵和培养的主要因子。试验中以玉米粉、酵母粉作为猴头菇液体培养基的碳源和氮源的菌丝生物量较高。通过正交试验，得到猴头菇液体培养基的最优配方组合A3B3C2 D3，即玉米粉2.0%、酵母粉0.3%、KH2PO40.1%、维生素B20.01%。

表2 不同配方液体培养基的猴头菇菌丝生物量

3 讨 论

3.1 液体培养基的碳源和氮源与猴头菇菌丝体生长的关系

猴头菇培养可以使用多种碳源和氮源，其中复合碳源（玉米粉和甘薯粉）作为液体培养基碳源的菌丝生物量较高，玉米粉又优于甘薯粉。推测菌丝体的培养需要附着物，玉米粉和甘薯粉可以起到这种作用。培养基中添加部分白砂糖和葡萄糖作为前期的碳源会更好。

酵母粉、麸皮粉、豆粕粉是猴头菇液体培养基的良好氮源，培养基中菌球分布均匀，大小一致。这与有机氮源营养丰富，氨基酸种类齐全密切相关。蛋白胨的菌丝量不如酵母粉、麸皮粉、豆粕粉，这可能与蛋白胨可溶性高，起不到附着物的作用有关，而酵母粉、麸皮粉、豆粕粉则能起到附着物的作用。

3.2 猴头菇适宜的液体培养基配方

在培养基筛选试验中使用正交设计，以使组合的各因子之间的关系均衡分布，保证试验的可比性。正交设计可使用较少的组合选择合适的培养基，是目前筛选培养基常用方法[8]。本试验中，在1.6%玉米粉添加量和3.2%糖添加量范围内，添加量与菌丝体干重呈正相关关系。试验结果确定2.0%玉米粉、0.3%酵母粉、0.1%KH2PO4、维生素B20.01%，是成本较低而菌丝生物量和性价比均较高的猴头菇液体培养基配方，可供作猴头菇子实体工业化生产和液体发酵的深入研究试验配方。