吴培东
天津市第五中心医院 (天津 300450)
细菌涂片是病原学诊断的经典方法,也是最直接、最简便、最快速的方法,但此方法对于种类繁多、数量庞大的肠道微生态系而言,仅可鉴定其中的1%,不能反映肠道微生物的真实情况,分析的结果与结论存在一定局限性。
1.2.1 针对16SrRNA、16SrDNA检测
16SrRNA为原核生物的核糖体RNA,该基因在细菌各种属之间既有高度保守的序列又有相互之间存在差异的碱基,且该基因种类少、丰度高(约占细菌RNA含量的80%)、分子大小适中,目前已广泛用于肠道菌群种属的鉴定,其缺点是只能鉴定已知菌群。原核生物核糖体小亚基16SrDNA,长度约1 500 bp,且其较16SrRNA稳定,不易受污染降解,易于发现新的菌种。
1.2.2 多重PCR快速检测
样本同时被多对引物扩增,肠道菌群的特有基因在电泳图谱上得到显示,从而达到鉴定的目的。
该类技术主要包括9种:(1)传统DNA指纹技术;(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE);(3)温度梯度凝胶电泳(TGGE);(4)PCR解链曲线分析技术(PCR melting profile);(5)脉冲场凝胶电泳(PFGE);(6)多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA);(7)限制性片段长度多态性(RFLP);(8)ERIC-PCR指纹图谱技术;(9)随机扩增多态性DNA技术(RAPD)。在以上方法中,PFGE在特异性、分辨性方面较理想,同时操作简便,是目前细菌分子分型的金标准[1]。
荧光原位杂交技术(FISH)在鉴定肠道菌群方面有较多应用,样本中的基因在标记特异寡聚核苷酸探针下,与已知肠道细菌的特异性DNA杂交,鉴定细菌种属。基因芯片技术又称DNA芯片,是固定的大量探针,标记样品与已知肠道细菌的特异性DNA杂交,通过检测杂交信号,达到鉴定的目的。
截止到2018年8月,拉萨市印刷行业小微企业共计237户。主要分布情况如下:布达拉宫——大昭寺商业圈从事印刷行业商户共计59户;西藏大学商业圈(江苏路-藏大东路一线)47户;柳梧新区商业圈36户;拉萨市经济技术开发区22户。四个主要商业圈合计164户,占据拉萨市印刷行业企业总数的69.20%。剩余企业则分散在拉萨市区周边,尚未形成集聚现象。
竞争性PCR技术,在模板中加入一种已知浓度的模板,组成2个PCR反应,根据引物位置和条带缺失,达到鉴定的目的。荧光定量PCR技术,是对反应体系中产物荧光信号实时检测的技术,用于肠道菌群基因分型、突变的鉴定。
2.1.1 非酒精性脂肪肝
在对非酒精性脂肪肝患者与正常对照组的研究中发现,厚壁、变形菌属的丰度增多,而拟杆菌属则降低,同时整体肠道菌群的多样性降低[2]。Liu等[3]通过给予SD大鼠不同类型的饮食发现,高脂肪和高糖饮食对非酒精性脂肪肝的诱导作用与热量摄入无关,而与肠道菌群的变化有关,提示肠道菌群可能在非酒精性脂肪肝的发病中发挥重要作用。
2.1.2 肝硬化
有研究对肝硬化患者肠道菌群基因测序进行分析,发现肠道菌群结构发生改变,链球菌、梭状芽孢杆菌、韦荣球菌、普氏菌菌属的丰度增高,而拟杆菌属丰度下降,共28种细菌关系紧密,今后可作为治疗的观察指标[4]。
2.1.3 慢性便秘
研究显示,成年便秘患者肠道内双歧杆菌、柔嫩梭菌、乳酸菌及产丁酸盐细菌的含量明显降低,而硫酸盐还原细菌数量上升,利用16SrRNA高通量测序技术发现,与对照组相比,便秘患者肠道内的普氏菌的丰度明显降低,几种代表性的厚壁菌丰度增加[5]。同时,有研究观察到铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌等条件致病菌有所增加[6]。
2.2.1 肥胖
相对于正常体重者,肥胖者的肠道菌群结构发生改变,拟杆菌属的丰度下降,而厚壁菌属丰度上升。
2.2.2 糖尿病
肠道菌群失衡可破坏正常能量储存过程,且可产生细菌毒素,引起脏器炎症,加重胰岛素抵抗。1型糖尿病儿童,随着时间及疾病的进展,相对丰富的厚壁菌减少,拟杆菌增加,但与其年龄及HLA相匹配的健康儿童,厚壁菌相对增加,拟杆菌减少。2型糖尿病患者肠道厚壁菌属比例降低,拟杆菌属、大肠埃希菌等条件致病菌水平升高,双歧杆菌等益生菌的含量明显减少。Sato等[7]发现乳酸菌属中的一部分致病菌或条件致病菌的丰度增加。
2.2.3 骨代谢疾病
Yan等[8]在长达8个月的小鼠粪菌移植实验中发现,微生物在粪菌移植初期会同时介导骨形成与骨吸收相关因子增加,导致骨转换暂时加快;随着移植期变长,则对骨形成的影响占主导地位,促进了小鼠长骨的纵向与径向生长,使骨量趋于均衡,且发现其作用机制可能与雌激素水平相关。Li等[9]发现肠道菌群主要通过介导炎症反应,调节激素代谢及肠上皮营养物质转运等途径作用于骨骼系统。此外,肠上皮黏膜通透性改变也是引起小鼠去势后骨量改变的机制之一。
Miyake等[10]较早观察到多发性硬化(MS)患者肠道菌群的变化,发现与正常对照相比,MS患者梭状芽孢菌属、拟杆菌属、普氏菌属和萨特菌属减少,这种变化在一定时间内保持相对稳定。有研究显示,炎症性肠病带状疱疹的发病率比非炎症性肠病高[11]。通过比较特应性皮炎婴儿与皮肤正常婴儿的肠道菌群发现,前者含有较多的梭状芽孢杆菌,而后者含有更多的双歧杆菌和乳酸杆菌。
心血管疾病患者的肠道菌群与健康人的肠道菌群相比在数量上发生了较大的变化,心血管疾病患者的大肠杆菌、肠球菌、链球菌数量均比健康人升高,这些升高的组分多是条件致病菌和过路菌。在慢性心力衰竭患者的粪便中,肠道菌群的丰富度降低,如布劳特菌和柯林斯菌,而沙门菌、弯曲杆菌、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌和念珠菌的数量增加[12]。张月和杨得振[13]研究发现,急性心肌梗死患者与非冠心病患者真菌、类杆菌属、双歧杆菌属、普拉梭菌、乳酸杆菌属、梭菌属Ⅰ、丛生梭菌、梭状芽孢杆菌、肠杆菌、肠球菌均存在显著差异,急性心肌梗死患者乳酸杆菌、肠球菌下降明显,肠杆菌升高明显。
Keshavarzian等[14]在对帕金森病的研究中发现,肠道菌群释放的炎性物质,使肠管通透性增加和细菌易位,造成肠道神经系统损伤,引起帕金森病。Singh等[15]研究急性脑卒中对肠道菌群的影响,发现在严重脑卒中3 d后,肠道菌群的多样性显著降低,厚壁菌属、拟杆菌属和放线菌属中特定细菌属有所改变,这是脑卒中后微生物群失调的一个重要特征。游超等[16]通过对脑梗死患者及健康人粪便样本提取的细菌DNA进行16SrRNA测序分析发现,肠杆菌、链球菌、韦荣球菌增加,拟杆菌、普氏菌减少。
在慢性肾脏病患者中,原有肠道菌表现为益生菌比例减少而产毒素菌群增加。有研究发现,短状杆菌、盐单胞菌科、莫拉氏菌、肠杆菌、假单胞菌增加,乳酸杆菌和普氏菌下降[17]。
有研究发现,胃肠功能紊乱、炎性肠病、抑郁症、自闭症患者均存在肠道菌群改变。有动物实验表明,处于长期受压状态的小鼠,肠杆菌减少,梭菌属增多[18]。
在对胃癌患者肠道菌群的研究中发现,厚壁菌、拟杆菌、梭杆菌、放线菌减少,而螺杆菌增加,胃炎患者没有以上表现[19]。
肠道菌群与人体的关系密切,在一些疾病中有一定的特定变化。随着检测技术的进步、发展,肠道菌群检测将很快得到开展并服务于临床工作,为疾病的诊断与治疗提供新的方法。