P-糖蛋白相关信号通路介导肿瘤细胞多药耐药机制的研究进展

刘亨晶，魏敏，孙瑾瑜，于晓辉，张久聪

1.解放军联勤保障部队第九四〇医院 消化内科，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学 临床医学院，甘肃 兰州 730000

多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤细胞免受化疗药物攻击最重要的防御机制，也是导致肿瘤化疗疗效降低或失败的主要原因之一。肿瘤细胞产生多药耐药的机制十分复杂，主要是通过上调一个或多个ABC细胞膜转运体，将肿瘤细胞内的化疗药物排出细胞外，使细胞内药物浓度降低实现的。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是具有典型特征的ABC细胞膜转运体之一，在具有耐药表型的肿瘤细胞中过度表达。目前研究表明，P-gp表达受多种信号通路调控，如核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路等。本文将对P-gp相关信号通路介导肿瘤细胞多要耐药的机制进行综述。

1 P-gp的基本结构、分布及功能

P-gp是在耐药细胞中发现的一种由1280个氨基酸残基组成的单链异二聚体膜蛋白[1]。P-gp由MDR1基因（ABCB1）编码，位于人7号染色体上，相对分子质量为170 000。P-gp由2个半转运体组成，每个转运体拥有2个跨膜结合域和2个核苷酸结合域，包含6个转运膜区和1个ATP结合利用区的部分构成，跨膜结合域与底物的跨膜转运有关，而核苷酸结合域能与ATP结合为底物转运提供能量[2]。

P-gp在人体中分布广泛，在肠、肝、肾、脑、睾丸、胎盘和眼睛等有分泌功能和排泄功能的上皮细胞膜上表达量相对较高，在人体重要屏障如血脑屏障、血睾屏障、胎盘和血-视网膜屏障的内皮细胞上也有分布[3]，可保护正常细胞及组织免受毒性物质的损害。P-gp的底物范围比较广泛，能够识别与转运一系列结构多样的重要内源性物质（如白三烯和雌激素结合物）和外源性物质及其代谢产物，包括多种化疗药物[4]。基于P-gp的结构和功能，其跨膜转运机制被广泛认为是P-gp分别与底物及2个ATP分子结合后，其中一个ATP分子发生水解引起底物结合位点构象的改变，进而导致跨膜结合域与底物之间亲和力急剧下降并释放、排出药物，从而导致耐药[5]。

2 PI3K/AKT信号通路对P-gp的调控机制

PI3K/AKT信号通路是细胞外生存和生长的主要信号转导途径，研究发现PI3K/AKT信号通路在多发性骨髓瘤、胃癌、肝细胞癌、乳腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中可过度激活，尤其在耐药的肿瘤细胞中高表达或过表达。PI3K由调节亚基（p85）和催化亚基（p110）组成，异二聚体p85/p110从细胞质移动到细胞膜上后磷酸化，AKT活化后可激活其下游雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、NF-κB 激酶抑制剂（inhibitor of nuclear factor κB kinase，IκB）、PTEN 等，调控耐药基因 MDR1的表达。Dong等[6]研究发现AKT特异性抑制剂MK-2206通过下调p-AKT、P-gp的表达水平，逆转MDR，结果表明PI3K/AKT信号通路的激活可上调P-gp的表达，介导肝癌细胞对索拉非尼的耐药。Liu等[7]发现PD-L1在多种肿瘤中表达上调，与PD-1相互作用后可激活PI3K/AKT，反向上调MDR1/P-gp的表达，导致乳腺癌细胞的MDR。知母皂苷A-Ⅲ、康莱特、苦参碱等多种药物可通过抑制PI3K/AKT信号通路在一定程度上逆转MDR，然而由于多条信号通路之间存在交叉，对P-gp的调节机制更加复杂，因此对于逆转剂的研发更加困难，可在现有药物的基础上进行深入研究。

3 MAPK信号通路对P-gp的调控机制

在肿瘤发生过程中，MAPK信号级联可被多种机制组成性地激活，在各种刺激信号调节P-gp表达介导MDR发生过程中发挥关键作用。MAPK信号通路主要由细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK组成。

ERK1/2在细胞增殖、分化、黏附、迁移等中发挥重要作用。大量研究表明ERK1/2的过度激活与肿瘤细胞对化疗的耐药性呈正相关，活化的ERK1/2进入细胞核后可直接激活许多转录因子，如ETS-1、AP-1（c-Jun或c-Fos）和c-Myc，进而促进MDR1的表达，上调P-gp，参与乳腺癌、肝癌等细胞MDR的发生。Ji等[8]研究发现，胃癌间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）外泌体中MDR1/P-gp的表达增加会导致钙离子进入胃癌细胞内，形成钙/钙调素复合物，激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaM-Ks）。CaM-Ks的激活可以活化其下游的Raf/MEK/ERK激酶级联，从而使MDR1的表达上调，介导MDR的产生，而CaM-Ks磷酸化抑制剂KN-93可以抑制CaM-Ks活化、MDR1的表达。因此，胃癌细胞MSCs外泌体是通过蛋白质激活CaM-Ks/Raf/MEK/ERK信号级联，而不是直接将MDR相关蛋白或mRNA转移到细胞内参与MDR。另一项研究发现在顺铂耐药的宫颈腺癌HeLa细胞中ERK1/2的磷酸化水平降低，P-gp的表达上调[9]，这与目前的多数研究结果相反。综上，ERK1/2信号通路在调控P-gp的表达，介导肿瘤细胞MDR发生过程中发挥了重要作用，抑制ERK1/2可在一定程度上逆转MDR，但是其表达在不同的耐药肿瘤细胞中可能呈现相反的水平，具体机制有待进一步研究。

JNK信号通路可以被细胞因子、毒素、药物和代谢变化等多种刺激激活，参与细胞分化、凋亡和应激反应，越来越多的证据表明JNK与MDR的发生密切相关。在5-氟尿嘧啶耐药的人肝癌细胞中，JNK信号通路的激活导致与MDR1基因启动子区结合的c-Jun表达上调，而c-Jun是JNK的代表性靶点，可以与c-JunB二聚形成转录因子AP-1，促进MDR1的表达[10]。在顺铂诱导HepG2耐药后，发现P-gp表达上调，JNK1/2磷酸化增加，用JNK信号通路抑制剂SP600125可通过下调P-gp的表达增强肝癌细胞对顺铂的敏感性[11]。同样，在阿霉素耐药的胃癌细胞和长春新碱耐药的人结肠癌细胞中也有类似的报道。相反，生脉注射液[12]、盐酸千金藤碱[13]、抗肿瘤药物桑根的提取物可通过激活JNK通路，使其下游底物Jun磷酸化水平增加，使耐药基因MDR1的表达降低，在一定程度上逆转了胃癌细胞的MDR。Liu等[14]发现在常氧状态下，JNK途径激活后增加了c-Jun和MDR1启动子中AP-1位点的结合，抑制了人小细胞肺癌细胞耐药基因MDR1的表达，而在缺氧状态下，JNK途径激活可诱导低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）转移到核内后与HIF-1发生二聚反应，进而与MDR1启动子中的低氧反应元件结合，使MDR1的转录增加。综上，JNK信号通路在肿瘤细胞的MDR中可能起着双重作用，这可能与肿瘤类型、凋亡刺激特性、肿瘤微环境和其他信号通路的参与有关，故对于JNK信号通路在MDR过程中发挥的作用须进行更深入的研究。

p38 MAPK是典型的苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化激活蛋白，MAPKKs对Thr和Tyr的双重磷酸化可激活p38 MAPK，然后激活其下游的多个MDR1基因转录因子如YB-1、AP-1等，调节P-gp的表达，从而介导MDR的发生。NF-κB是p38 MAPK下游重要的转录因子，激活后也可调节P-gp的表达。Luo等[15]报道p38 MAPK激活引起的NF-κB易位可使慢性粒细胞白血病细胞MDR1的过表达和对伊马替尼耐药性的增加，白藜芦醇能显著抑制阿霉素耐药的骨肉瘤细胞中p38 MAPK（磷酸化）和p65（乙酰化）的表达水平，使MDR1和P-gp的表达下调，逆转骨肉瘤细胞的阿霉素耐药[16]。积雪草酸可通过抑制ERK1/2、AKT、p38 MAPK和JNK的磷酸化降低，阻断YB-1的核转位而导致P-gp表达水平降低[17]。这些结果均提示在p38 MAPK信号通路激活的同时，其他信号通路也可能被激活共同参与肿瘤细胞MDR的发生，因此，可联合使用信号通路的特异性抑制剂来逆转MDR，但要注意的是联合治疗是否会影响细胞正常的生理功能。除上述机制外，p38 MAPK诱导的细胞外刺激，如氧化应激、低渗、紫外线照射和缺氧等，与肿瘤细胞的MDR有一定关系[18]，调控p38 MAPK信号通路的活性可能会改善肿瘤微环境，进而逆转MDR。

4 NF-κB信号通路对P-gp的调控机制

NF-κB是一个普遍存在的转录因子家族，可被细胞因子或DNA损伤剂，如化疗药物等刺激激活。在肝癌、大肠癌等肿瘤细胞中，NF-κB通过衔接蛋白向信号分子NF-κB激酶（IKKs）传递信号，导致IKKs磷酸化，抑制蛋白IkBα降解，p50/p65核转移，进而使NF-κB信号通路活化，调节耐药基因MDR1的表达水平。Sun等[19]通过计算机序列分析及免疫共沉淀对其分子机制进一步研究，发现MDR1启动子区域存在NF-κB的结合位点（2324～2315处的GAAATTTCC），NF-kB激活后可能直接与MDR1基因启动子结合，使P-gp过表达，导致MDR的产生。

Chen等[20]发现NF-κB在细胞中的持续激活可导致抗凋亡蛋白BCL-2上调，BCL-2通过反馈机制下调IκBα的表达，进一步增强NF-κB的激活与MDR1的启动子结合，激活MDR1的转录并上调P-gp的表达，抑制细胞凋亡，介导MDR的产生。反之，用NF-κB特异性抑制剂、siRNA技术靶向干预NF-κB基因后MDRl、P-gp明显下降，导致肿瘤细胞凋亡增加[21]。综上，MDR的发生是一个由信号通路及凋亡和耐药基因组成的复杂网络共同调控的，抑制或siRNA技术靶向干预NF-κB信号通路是逆转MDR的重要靶点。

5 其他信号通路对P-gp的调控

除上述经典的信号通路外，其他信号通路也可以调控P-gp的表达介导MDR。Liu等[22]研究发现长非编码RNA CCAL可激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制AP-2α，进而上调MDR1/P-gp的表达，诱导大肠癌细胞产生MDR。Wnt/β-catenin信号通路激活也可调控乳腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤细胞中P-gp的表达介导MDR。Jeddi等[23]研究发现MDR1的启动子包含核因子E2相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）的结合位点，胃癌细胞中Nrf2过表达使下游基因MDR1表达上调，导致P-gp外排作用增强。STAT3信号通路抑制后可以逆转胃癌、乳腺癌、肝癌等细胞的MDR。上述信号通路调控P-gp参与MDR的相关研究相对较少，可能是目前尚未引起重视，但其在MDR发生过程中的作用不容忽视，应该进行深入的研究，可能为逆转MDR提供重要的治疗靶点。

6 结语

MDR是影响肿瘤化疗疗效的主要因素之一，ABC细胞膜转运蛋白P-gp的过表达可降低细胞内化疗药物的浓度，介导MDR发生。近年来越来越多的研究发现P-gp的表达受到一个或多个信号通路的调控。因此，了解P-gp相关信号通路介导MDR的机制可能为逆转MDR提供潜在的靶点，为研发疗效显著的化疗药物提供临床思路，进而提高恶性肿瘤化疗疗效，改善疾病预后及提高患者的生存质量。