基于灰色关联法分析栀子提取物抗炎作用谱效关系

黄 潇，刘 婧，吴建华，付小梅，吴志瑰，裴建国，彭佳鹂，王 芳，杨 超，肖雅静

（江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004）

栀子是茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果实，性寒、味苦，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效，作为常用清热药之一，现代药理研究已经表明其具有良好的抗炎作用［1］。虽然目前研究发现其中单个成分具有一定的抗炎作用［2-3］，但却忽略中药是多组分、多靶点综合作用的复杂整体，其药效应由多个有效成分共同作用多个靶点产生，而栀子中含有众多成分，主要包括环烯醚萜类及其苷类、西红花苷类、有机酸类［4］，但这些成分与抗炎作用的相关程度如何，是否存在协同作用尚未见有文献报道。

因此，本研究建立不同采收期栀子药材的HPLC 指纹图谱，采用角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型作为炎症模型，测定相关抗炎指标NO、IL-1β、PGE2、TNF-α，最后采用灰色关联分析法将指纹图谱与炎症相关药效进行关联，以期筛选出栀子抗炎作用的药效物质基础，为其后期深度开发和利用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 型高效液相色谱仪（四元泵、柱温箱、DAD 检测器，美国安捷伦公司）；KQ-300DE 数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；BS224S 型电子天平（德国赛多利斯公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman-Coulter 公司）；PV-200 足趾容积测定仪（成都盛泰科技有限公司）；SpectraMax M2 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）。

1.2 药物和试剂 吲哚美辛肠溶片（批号A130803，山西云鹏制药有限公司）；角叉菜胶（批号22049-5G-F，美国Sigma 公司）。磷酸（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，西陇化工有限公司）。IL-1β试剂盒（批号331717）、PEG2试剂盒（批号339437）、TNF-α 试剂盒（批号331520）均购于美国R＆D Systems 公司；NO 试剂盒（批号20151226）、考马斯亮蓝试剂盒（批号20151217）均购于南京建成生物工程研究所。对照品京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ均为自制，经1H-NMR、13C-NMR、MS鉴定结构，质量分数按面积归一化法测定均大于98%。

栀子由课题组采自江西新干栀子种植基地，以2013年霜降（10 月23 日）为节点，在此前后定期采集8 批，信息见表1，经江西中医药大学药学院范崔生教授鉴定为栀子Gardenia jasminoidesEllis 的果实，凭证标本保存于江西中医药大学中药鉴定学教研室。除去果梗和杂质，蒸至上气或置沸水中略烫后取出，干燥，放入自封袋中保存备用。

1.3 动物 雄性SD 大鼠，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2013-0004，饲养于江西中医药大学药学院动物室内，温度（24±2）℃，相对湿度（55±2）%。

表1 样品信息

2 方法和结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 供试品溶液制备 分别称取S1～S8 号生栀子6.5 g，加入65 mL 70% 乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，3 000 r／min 离心20 min，0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.2 混合对照品制备的对照品溶液 精密称取对照品京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ适量，加乙醇制成适宜质量浓度，即得。

2.1.3 色谱条件 Agilent Eclipse C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，6% A；10～18 min，6%～12% A；18～22 min，12%～16% A；22～28 min，16%～20% A；28～40 min，20% A；40～60 min，20%～36% A；60～65 min，36%～55%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量5 μL。

2.1.4 线性关系考察 将对照品溶液按不同比例稀释，在“2.1.3”项色谱条件下进样。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程为Y＝2.869X＋15.662（R2＝0.999 8），在0.623～6.23 mg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.5 指纹图谱方法学考察 取“2.1.1”项下供试品溶液，考察精密度、稳定性、重复性，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，发现其结果均＜3.0%，均符合指纹图谱建立的技术要求。

2.1.6 指纹图谱建立 分别将8 批不同采收期栀子在“2.1.3”项色谱条件下进样，得到指纹图谱，见图1。共确定31 个共有峰，其保留时间、峰面积、最大吸收波长见表2。与对照品相比，9 号峰为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷，10 号峰为栀子苷，26 号峰为西红花苷-Ⅰ，28 号峰为西红花苷-Ⅱ，30 号峰为西红花苷-Ⅲ。

图1 8 批不同采收期样品HPLC 指纹图谱

表2 8 批样品指纹图谱共有峰相对保留时间、峰面积及最大吸收波长

2.2 抗炎作用

2.2.1 浸膏制备 分别称取S1～S8 号生栀子65 g，加入650 mL 70%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，用旋转蒸发仪回收乙醇至无醇味后进行冷冻干燥，得到栀子干浸膏，其得膏率约为15%。临用前加5%CMC-Na 制成混悬液进行使用，剩余混悬液在4 ℃冰箱保存。

2.2.2 栀子提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响 选用雄性SD 大鼠80 只，适应性饲养1 周后进行分组。随机分为 10 组，分别为 5% CMC-Na 组、吲哚美辛组（17.5 mg／kg）、生栀子S1～S8 组灌胃给药（按生药给药剂量折算为2.1 g／kg），每组8 只，连续给药4 d。在末次给药后1 h，各组大鼠的右后足跖皮下注射0.1 mL 1%角叉菜胶溶液致炎，在致炎后3 h 测定每只大鼠右后足趾致炎后的体积，计算致炎前后体积差以确定抗炎效果，并以足肿胀度作为药效指标。结果见表3。与模型组比较，各给药组大鼠足肿胀度均降低（P＜0.01），各给药组之间比较存在差异（P＜0.01），表明这8 批栀子均具有较好的抗炎作用。

2.2.3 栀子提取物 对炎症组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2的影响 选择确定有抗炎效果的给药组，脱颈处死大鼠，并剪下炎症右后足，称定质量，以预冷的0.9% NaCl 溶液为匀浆介质，制备成10%组织匀浆，4 ℃下3 000 r／min 离心15 min，匀浆留上清，测定组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平，按照试剂盒说明书进行操作，结果见表4。与模型组比较，各给药大鼠组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2均降低（P＜0.01），表明这8 批样品均具有降低炎症因子水平的能力。

表3 8 批样品对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（±s）

表3 8 批样品对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

表4 8 批样品对炎症组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的影响（±s）

表4 8 批样品对炎症组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的影响（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

2.3 栀子提取物指纹图谱与抗炎因子的灰色关联分析［5］以8 批不同采收期栀子足肿胀度以及炎症因子作为参考序列，以栀子HPLC 图谱共有峰峰面积作为比较序列，进行灰度关联分析。

2.3.1 原始数据无量化处理 由于数据中物理意义不同，所以数据的量纲也不一定相同，不便于比较，或在比较时难以得到正确的结论。因此在进行灰色关联度分析时，需要将数据统一进行无量纲化处理。本研究采用的无量纲化方法是初值化法。

2.3.2 计算参考数列与比较数列的灰色关联系数 分别计算每个比较序列和参考序列所对应元素的关联系数，其公式如下。

式中，x0（k）和xi（k）分别为栀子各批次提取物抗炎药效指标及各批次提取物特征峰面积，均做无量纲化处理；k为峰号；ρ为分辨系数，在0～1 内取值，若ρ越小，关联系数间差异越大，区分能力越强，一般情况下ρ取0.5。

2.3.3 计算灰色关联度 关联系数的算术平均数为关联度，其计算公式如下。

式中，n为子序列个数。关联度计算结果结果见表5，可知8 批栀子共有峰与足肿胀度作用的关联数据，对抗炎作用药效贡献度较大（关联度＞0.65）的共有峰（峰号）主要有10＞2＞9＞4＞3＞26＞1＞31＞23＞28＞12＞29＞21，由此说明栀子提取物的抗炎作用是化学成分群共同作用的结果，其中对抗炎作用贡献最大的前5 个峰分别为10、2、9、4、3 号峰，与“2.1.6”项下结果比较可以得知，10 号峰为栀子苷、9 号峰为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。其中，对NO 贡献较大的共有峰（峰号）主要有10＞4＞11＞3＞25＞2＞9＞23＞29＞22＞24＞15＞16＞30＞5，对IL-1β 贡献较大的共有峰（峰号）主要有10＞20＞13＞18＞25＞4＞9＞3＞2＞27＞15＞5，对TNF-α 贡献较大的共有峰（峰号）主要有1＞10＞2＞3＞9＞16＞15＞11＞7＞18＞4＞21＞12＞14＞17；对PGE2贡献较大的共有峰（峰号）主要有3＞10＞5＞13＞2＞9＞14＞23＞4＞29＞17＞8＞31＞11＞24＞27＞28＞12。综合比较可以发现，10、2、9、4、3 号峰对各个炎症因子均起到较大的贡献度。

表5 8 批样品峰面积与足肿胀度及炎症组织中NO、IL-1β、TNF-α、PGE2水平的关联度

3 讨论

本实验建立在栀子指纹图谱的基础上，对于栀子中所含的主要成分，在利用HPLC 法测定图谱时所选择的波长并不相同，通常环烯醚萜类及其苷类为238 nm，有机酸类为320 nm，西红花苷类为440 nm，因此为得到同一波长下栀子各成分的指纹图谱，选用210 nm 作为检测波长。

为了能够对共有峰的结构类型进行推测，故采用HPLC 对31 个共有峰进行全波长扫描。根据文献报道［6-7］以及前期研究可以得知，环烯醚萜类成分的最大吸收波长为238 nm 附近，故推测峰1、2、3、9、10、11、13、16、17、18、19、20、21、22 为环烯醚萜类成分；西红花苷类成分最大吸收波长为440 nm 附近，故推测峰26、28、29、30、31 为西红花苷类成分。

栀子作为常用中药之一，之前研究已经表明其具有较好的抗炎作用，然而对其具体的抗炎物质并没有探索，而中药作为一个极其复杂的化合物体系，其发挥治疗作用的原因很有可能是由几种成分甚至几类成分互相作用的结果，通过 谱效关系研究，对揭示药效物质基础极为重要［8］。故以角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型作为炎症模型，选用足肿胀度作为抗炎的药效指标，并在此模型上采用灰色关联分析方法将栀子共有峰和抗炎药效相互关联，从而筛选出栀子抗炎作用的药效物质基础。研究发现对抗炎作用贡献最大的前5 个峰为10、4、2、9、3 号峰，其中10、2、9、3的最大吸收波长均为238 nm 左右，故此推测这4 种成分为环烯醚萜类。同时与对照品的液相谱图比较可以得知，10号峰为栀子苷，9 号峰为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。这也与之前文献报道环烯醚萜类具有较好抗炎作用相符［9-11］。栀子苷为2015 年版《中国药典》规定的药材评价指标成分，根据标准曲线，S1～S8 批栀子的栀子苷含有量分别为36.13、34.55、31.61、30.89、35.21、29.79、26.86、35.99 mg／g。

中药是作为一个多组分、多靶点综合作用的复杂整体，其药效作用应由多种有效成分共同作用多个靶点产生的效果，而炎症的发生正是由于机体受到各种损伤因子刺激后，血管系统的活体组织产生的防御反应，整个过程是1 个复杂的级联反应，其抗炎作用往往受到多条通路进行调节。故本研究同时选用调节不同炎症通路的相关因子作为指标进行研究，花生四烯酸代谢产物之一PGE2，致炎因子IL-1β、TNF-α 以及由氧分子以L-精氨酸为底物在一氧化氮合酶催化生成的小分子的NO［12-13］。通过测定大鼠炎症组织中NO、PGE2、IL-1β、TNF-α 水平，发现栀子提取物能通过显著抑制NO 的产生，减少PGE2的生成，抑制炎症因子IL-1β、TNF-α 的合成与释放来发挥其抗炎作用。同时本实验采用灰色关联分析将栀子共有峰和抗炎因子相互关联，结果表明10、4、2、9、3 号峰均对这些因子起着较大的贡献，进一步说明栀子中的这些成分均有一定抗炎作用，只不过是通过不同炎症通路进行调节。由此可知，这些成分起着相互协同的作用，正符合中药“多成分，多靶点”综合作用的特点。

下一步的工作重点是对这些共有峰进行定性分析、药效评价等研究，以期进一步确定栀子抗炎作用的物质基础，为开发新型抗炎中成药打下基础。