苦参碱固体脂质纳米粒的制备和处方优化

李莹莹，孙冰冰，张廷廷，李松涛，赵红玲，王汝兴

（承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000）

苦参为我国传统中药材，其主要化学成分为苦参碱，具有抗肿瘤、强心、抗炎、抗菌、免疫抑制等多种药理作用［1］。目前，临床上主要有栓剂、肠溶片、注射剂、胶囊剂等传统剂型［2］。

固体脂质纳米粒是以毒性低、生物相容性好、稳定性高、以生物可降解的固态天然或合成类脂为载体，与表面活性剂共同构成不规则骨架，将药物吸附或包裹于其中而制成的新型纳米粒给药系统［3-4］。纳米粒是一种在室温及体温下为固态的胶状微粒，平均粒径50～1 000 nm，可控制药物释放、靶向传递，适合多种给药途径［5-7］，其所含的亲脂性材料使药物包裹于脂质结构中，可提高包封率和细胞透过率，从而增加细胞内药物浓度［8-9］，制备方法有高压均质法、微乳法、溶剂蒸发法、乳化蒸发-低温固化法、熔融超声法、高剪切乳化超声法、溶剂注射法等［10］，其中超声分散法制备苦参碱纳米粒时操作简单，易于控制，但所得纳米粒稳定性较差，振荡后会产生白色絮状物［11］；乳化蒸发-低温固化法制备时虽然稳定性较好，但存在引入毒性有机溶剂、包封率不高等问题［12］。因此，本实验采用高压均质法制备苦参碱固体脂质纳米粒，并通过正交试验优化其处方，为该成分临床应用提供参考。

1 材料

1.1 仪器 JA2003 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JY92-ⅡN 超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；FSH-2 高速分散均质机（常州市伟嘉仪器制造有限公司）；GT16-3 高速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；ZEN3690 激光粒度仪（英国马尔文公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；LGJ-22D冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）；AH-2010 高压均质机（ATS 工业系统有限公司）。

1.2 试剂与药物 苦参碱对照品、原料药（批号17061508）（成都普菲德生物技术有限公司）。吐温-80（天津市化学试剂批发公司）；硬脂酸（天津市东丽区天大化学试剂厂）。其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苦参碱含有量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent ODS C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相乙腈-磷酸二氢钾（6∶94）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。

2.1.2 线性关系考察 精密称取苦参碱对照品3.0 mg，以“2.1.1”项下流动相定容于10 mL 量瓶中，得300.0 mg／mL 贮备液，流动相分别稀释至6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg／mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），溶液质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为Y＝16.17X－14.531（r＝0.999 9），在6.25～200.0 mg／mL 范围内线性关系良好。色谱图见图1。

2.1.3 精密度试验 取25.0、50.0、100.0 μg／mL对照品溶液，每天在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6 次，考察日内精密度；连续测定3 d，每天1 次，考察日间精密度，测得两者RSD 分别为0.14%、0.17%，表明该方法精密度良好。

图1 苦参碱HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of matrine

2.1.4 加样回收率试验 精密量取208.0 μg／mL对照品溶液0.6、0.75、0.9 mL，各3 份，置于10 mL量瓶中，加入1 mL 空白纳米粒溶液，流动相定容至刻度，得到12.48、15.60、18.72 μg／mL溶液，各3 份，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，苦参碱平均加样回收率为101.06%，RSD 为0.01%。

2.2 包封率测定 精密吸取固体脂质纳米粒混悬液800 μL，置于超滤离心管中，10 000 r／min 离心30 min，取上清液20 μL，流动相定容至2 mL，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算游离药量W游离。另精密吸取0.5 mL，乙腈破乳后定容至50 mL 量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算总药物量W总，计算包封率，公式为包封率＝［（W总－W游离）／W总］×100%。

2.3 苦参碱固体脂质纳米粒制备 精密称取1.0 g硬脂酸、0.30 g 吐温－80，80 ℃下加热熔融作为油相；取纯化水适量，加热至85 ℃作为水相。精密称取苦参碱0.2 g，超声溶于水相中，1 300 r／min搅拌下将水相迅速加到油相中，继续搅拌10 min，形成初乳，12 000 r／min 下高速分散5 min，高压均质机在90 MPa 压力下作用40 个循环，冰浴过夜，即得。

2.4 粒径、Zeta 电位测定［13］称取适量苦参碱固体脂质纳米粒，室温下纯水稀释，探头超声处理后激光粒度仪测定其粒径、PDI 和Zeta 电位。结果，三者分别为90.41 nm、0.303、－24 mV。

2.5 正交试验 根据预试验和单因素试验结果，以吐温-80 用量（A）、均质压力（B）、药脂比（C）为影响因素，包封率为评价指标，采用L9（34）正交设计表安排试验。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表可知，各因素对包封率均有显著影响（P＜0.05，P＜0.01），影响程度依次为C＞A＞B；最优处方为A3B2C2，即吐温-80 用量0.3 g，均质压力90 MPa，药脂比1∶5。

按优化处方制备3 批固体脂质纳米粒，测得包封率分别为95.02%、94.94%、92.49%，平 均（94.15±1.44）%，表明工艺稳定可行。

3 讨论与结论

高压均质法是超微细化液体物料或以液体为载体的一种新技术，它可使物料细化为微米级至纳米级［14］，在制药工业中广泛用于制备脂质体、纳米粒、微乳等剂型，其核心应用设备为高压均质机。一般来说，高压均质机均质压力越大，均质循环次数越多，则原料粒径越小。

课题组前期预实验发现，硬脂酸固体脂质在高压均质机内进行均质时，没有立即堵塞高压均质机管道，故可进行操作。本实验对吐温-80 用量、剪切机转速、均质压力、均质次数、温度、溶剂用量等因素进行了考察，发现在使用高压均质机前以热水预热时，所得纳米粒的粒径和PDI 较小，而在常温下恰好相反；考察药脂比时发现，热水预热后高压均质机所得纳米粒的粒径均小于100 nm，表明热匀法制备效果更好。

在单因素试验中以粒径和Zeta 电位为评价指标，考察处方和工艺对纳米粒的影响，然后在此基础上采用正交试验优化最终处方。结果，优化处方所得纳米粒的粒径和Zeta 电位变化不大，而处方变化对包封率影响较大，其原因可能是由于这会改变纳米粒与苦参碱的亲和力，进而影响了对该成分的包封效果，而高压均质机具有较强的机械力，可消除正交试验范围内的粒径变化。因此，在正交试验中只选择包封率作为评价指标，最终优化处方也印证了该结果。

与以往文献报道比较，虽然本实验也制备了苦参碱固体脂质纳米粒，但由于采用高压均质法，故粒径较小，分布较均匀，包封率较高，同时避免了向体系内加入毒性较大的有机溶剂，以及因超声法分散时间过长而引起的金属污染等问题，适合工业化生产，具有一定应用前景。