三七总皂苷微乳在家兔眼部的药动学研究

邢 月，卢 鹏，闫宏丽，梁春霞，谢佳蓉，刘志东

（天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程中心，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津 301617）

三七是我国传统名贵中药，具有散瘀止血、消肿定痛的作用［1］，其主要成分三七总皂苷在扩张血管、改善微循环障碍、抑制血小板凝集、缓解视网膜缺血缺氧状态等方面疗效显著［2-4］。目前，以该成分为单一主药上市的制剂大多为注射给药制剂与口服制剂，可治疗视网膜中央静脉阻塞症、角膜病、内眼病、眼前方出血、糖尿病性视网膜病变等眼部疾病［5-6］。

微乳作为一种新型药物制剂，是由水相、油相、表面活性剂、助表面活性剂，按一定比例自发形成的一种粒径≤200 nm 的分散体系［7-8］，具有黏度低、热力学稳定、制备简单、生物相容性好、注射时可减少患者疼痛感等优点［9-10］。

课题组前期制备了三七总皂苷微乳，并进行了药动学研究［11］。本实验在此基础上通过家兔耳缘静脉注射给药，研究其药动学，对相关制剂开发与改进具有一定参考意义。

1 材料

1.1 仪器 高压均质机（ATS 工业系统有限公司）；FA25 高剪切分散乳化机（德国Fluko 公司）；Nano ZS 激光粒径测定仪（英国Malvern 公司）；KQ-400DE 高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore 公司）；液质联用仪（美国Agilent 公司，配置Agilent 1290 高效液相色谱仪、Agilent 6460 三重四级杆质谱仪、MassHunter 工作站）；FA124 电子天平（万分之一，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AX205 电子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；SZCL-4B 智能磁力加热搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；CMA402 微透析泵、CMA30线型微透析探针（瑞士CMA 公司）。

1.2 试剂与药物 三七总皂苷原料药（云南玉溪万方天然药物有限公司，批号021108，人参皂苷Rg1质量分数44.470%，三七皂苷R1质量分数14.056%）；大豆磷脂（上海艾韦特医药科技有限公司，批号SY-SI-170103）；油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944CS，法国佳法赛公司）。人参皂苷Rg1（批号110703-201832，质量分数92.4%）、三七皂苷 R1（批号 110745-201820，质量分数93.1%）对照品（中国食品药品检定研究院）。注射用血栓通（冻干）（广西梧州制药集团有限公司，批号17010216，人参皂苷Rg1质量分数48.117%，三七皂苷R1质量分数10.370%）。去离子水（由Milli-Q 纯水机制备）；其他试剂均为色谱纯。

1.3 动物 新西兰白兔，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，由天津中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（津）2014-0001，动物伦理号TCM-LAEC2018031。

2 方法与结果

2.1 三七总皂苷微乳制备及初步评价 微乳制备采用课题组前期报道的方法［11］，处方为58%Labrafil M 1944CS、25%磷脂／乙醇（Km＝1）、17%三七总皂苷溶液（400 mg／mL）。按处方量称定油相、乳化剂、三七总皂苷溶液于烧杯中，50 ℃水浴搅拌均匀，分散3 min 后80 MPa 下均质5 次，即得。激光粒度测定仪测定其粒径，结果见图1，可知微乳（人参皂苷Rg1、三七皂苷R1质量分数分别为1.983%、0.606%）平均粒径为（170.23±0.91）nm，PDI 为0.29±0.01。

图1 微乳粒径分布Fig.1 Particle size distribution of microemulsions

2.2 含有量测定

2.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～7 min，18% B；7～13 min，18%～40%B；13～14 min，40%～18%B；14～15 min，18% B）；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.2.2 质谱条件 电喷雾离子（ESI）源，正离子模式，多反应离子监测（MRM）；人参皂苷Rg1m／z823.48～643.3，三七皂苷R1m／z955.52～775.3；碰撞电压，人参皂苷Rg1280 V，三七皂苷R1300 V；碰撞能量，人参皂苷Rg142 eV，三七皂苷R150 eV；电喷雾电压4 kV；雾化气体N2；喷雾气40 psi（1 psi＝6.895 kPa）；干燥气温度350 ℃。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取空白、对照品、供试品微透析液，在“2.2”项条件下进样测定，结果见图2，可知对照品、供试品微透析液中人参皂苷Rg1、三七皂苷R1保留时间一致，空白微透析液无干扰，表明该方法专属性良好。

图2 方法专属性色谱图Fig.2 Chromatograms of method specificity

2.3.2 线性关系考察 精密称取人参皂苷Rg1、三七皂苷R1对照品适量于10 mL 量瓶中，甲醇稀释成每1 mL 分别含两者1.022、0.98 mg 的溶液，精密量取适量，0.9% NaCl 溶液稀释成系列质量浓度，在“2.2”项条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为Y＝33.562X－5.304（R2＝0.999 4）、Y＝46.037X－7.760（R2＝0.999 6），分别在0.511～511、0.490 5～490.5 ng／mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取低、中、高质量浓度对照品溶液，平行6 份，于日内、日间在“2.2”项条件下进样测定，结果见表1，可知该方法精密度良好。

表1 各成分精密度试验结果（n＝6）Tab.1 Results of precision tests for various constituents（n＝6）

2.3.4 稳定性试验 取低、中、高质量浓度对照品溶液，平行6 份，在“2.2”项条件下进样测定，考察人参皂苷Rg1、三七皂苷R1分别在室温下放置15 h、4 ℃下放置12 h 的稳定性。结果见表2，可知溶液在相应条件下稳定性良好。

2.4 探针体内回收率测定 实验前，向家兔右眼周围皮下注射盐酸利多卡因（0.75 mL／kg）充分麻醉［12］，在兔眼对外部刺激无反应时撑开眼睑，沿角膜结膜缘前将10 mL 针头倾斜刺入眼前房室内，沿针头一端将微透析探针的透析窗嵌入眼内，抽出针头，调整透析窗，使其完全置于房水中，针两端分别在鼻翼侧和外眼角固定［13］。然后，将微透析探针植入家兔眼内，使用微透析泵，以5、25、100、500、1 000 ng／mL NaCl 溶液为灌注液，体积流量1.5 μL／min，每种质量浓度平衡30 min，每30 min 收集1 份样品，平行3 次，测定探针体内回收率，回收率＝［（Cd-Cp）／Cp］×100%，其中Cd为透析液中含药量，Cp为灌注液中含药量［14］。结果，人参皂苷Rg1、三七皂苷R1探针体内回收率分别为（28.07±1.42）%、（22.74±0.71）%。

表2 各成分稳定性试验结果（n＝6）Tab.2 Results of stability tests for various constituents（n＝6）

2.5 药动学研究 12 只家兔随机分成2 组，每组6只，分别给予微乳和注射用血栓通（冻干）溶液（精密称取血栓通冻干粉355.4 mg 于50 mL量瓶中，0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，配制成7.108 mg／mL溶液）。按“2.4.1”项下方法操作，以1.5 μL／min体积流量向探针内灌注生理盐水，平衡1 h 后耳缘静脉注射6.74 mg／kg 微乳和注射用血栓通（冻干）溶液（以人参皂苷Rg1计，0.34 mL 前者相当于1.97 mL 后者），开始收集透析液，0～6 h 每30 min收集1 份，6～8 h 每1 h 收集1 份。然后，通过LC-MS／MS 法测定微渗析液中人参皂苷Rg1、三七皂苷R1含有量，WinNonlin6.0 版药动学软件、SPSS 22.0 统计学软件进行数据处理与分析，组间比较采用t检验。

血药浓度-时间曲线见图3，主要药动学参数见表3。由此可知，微乳组人参皂苷Rg1、三七皂苷R1Cmax、AUC0～8h、Vz／F、CL／F高于注射用血栓通（冻干）组（P＜0.05，P＜0.01）。

图3 样品血药浓度-时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves for samples

表3 样品主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

表3 样品主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.3 Main pharmacokinetic parameters for samples（±s，n＝6）

注：与注射用血栓通（冻干）组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论与结论

三七总皂苷为水溶性成分，分子结构大，不易透过血眼屏障，故可利用其微乳给药系统提高其渗透性，改善其在眼部的生物利用度。本实验基于微透析技术，通过兔耳缘静脉注射三七总皂苷微乳及注射用血栓通（冻干）进行眼部药动学研究，发现相较于注射用血栓通（冻干）组，三七总皂苷微乳组人参皂苷Rg1、三七皂苷R1的Cmax、AUC0～8h显著升高，Vz／F、CL／F显著降低，生物利用度分别为（290.62±63.64）%、（587.78±148.07）%，表明三七总皂苷微乳在家兔眼内消除速度慢，可显著增加药物在眼部的浓度，从而更好地透过血眼屏障，提高生物利用度。其原因一方面是由于三七总皂苷微乳中的油相可增强其亲脂性，进而提高药物血眼屏障渗透性［15］；另一方面，微乳粒径较小，可增大药物与眼部的接触面积，更易透过血眼屏障，从而促进药物吸收［16］。

本实验采用的LC-MS／MS 法准确度高，专属性好。另外，三七总皂苷微乳组人参皂苷Rg1、三七皂苷R1在家兔眼部中的药物浓度到达Cmax后迅速下降，其原因有待进一步研究。本实验通过兔耳缘静脉注射三七总皂苷微乳，利用其高渗透、小粒径特性提高了三七总皂苷在眼部的生物利用度，为其治疗眼部疾病及相关制剂开发奠定了基础。