清热祛湿颗粒HPLC 特征图谱

林忠泽张用钊黄燕玲吴盼盼盛钊君张清民∗

（1.特一药业集团股份有限公司，广东 台山529200； 2.五邑大学，广东 江门529000）

清热祛湿颗粒由苍术、野菊花、陈皮、党参、茵陈、岗梅根、黄芪7 味药材制备而成，具有清热祛湿、益气生津功效，用于暑湿病邪引起的四肢疲倦、食欲不振、身热口干。清热祛湿颗粒现行质量标准（部颁标准中药成方制剂第九册WS3-B-1841-94）仅是简单的对陈皮进行薄层鉴别，而相关研究的文献报导也多为单味药材、单个成分的检测［1-3］，缺乏整体反映清热祛湿颗粒内在质量的分析方法。特征图谱是一种多指标的质量控制模式，能够对中药中大量化学成分信息进行提取及量化，较为全面地反映所含化学成分的种类和数量及某些重要的特征信息，实现中成药的整体评价和对质量有效控制［4-6］。本研究在参考相关研究［7-15］的基础上，采用HPLC 法建立清热祛湿颗粒特征图谱，以期为其内在质量控制提供依据。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Chromeleon 色谱数据工作站（美国戴安公司）；BP211D 型电子天平（万分之一，北京赛多利斯仪器系统有限公司）；JP-C900 超声波清洗器（广州市吉普超声波电子设备有限公司）。

绿原酸、橙皮苷、蒙花苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品及岗梅对照药材，均购于中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413、110721-201316、11528-201308、111920-201304、12115-200502。10 批清热祛湿颗粒由特一药业集团股份有限公司（原广东台城制药股份有限公司）提供，规格10 g／袋。

甲醇、乙腈为色谱纯（上海星可高纯溶剂有限公司）；磷酸为分析纯（广州化学试剂厂）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 资生堂C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；检测波长220 nm；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照溶液

2.2.1.1 对照品 分别取绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含25 μg 的溶液，即得。

2.2.1.2 对照药材 取岗梅对照药材1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，浸泡30 min，超声处理（功率250 W，频率50 Hz）30 min，取出，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取清热祛湿颗粒适量，研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一样品溶液（批号20151001）10 μL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，记录特征图谱，以9 号峰（蒙花苷）为参照峰（S 峰），各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一样品（批号20151001），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.8%，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液（批号201611104），在“2.1”项色谱条件下于0、2、4、6、8、10、12 h 测定，各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.3%，相对峰面积RSD 均小于2.0%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4 特征图谱建立 取10 批清热祛湿颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，结果见图1。通过对10 批供试品特征图谱的分析，选择稳定性、重复性好和特征明显的色谱峰为共有峰，共有特征峰9 个。建立清热祛湿颗粒特征图谱共有模式，9 号峰峰形和峰高最好，作为参照峰，各共有特征峰相对保留时间RSD 均小于0.5%，见图2、表2。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱

图2 清热祛湿颗粒HPLC 特征图谱

表2 10 批样品共有峰相对保留时间

2.5 特征峰归属 精密吸取供试品溶液、岗梅对照药材溶液、对照品溶液、空白溶液（甲醇），在“2.1”项色谱条件下测定，通过各峰保留时间对比分析，确认了部分峰的归属，结果见图3～5。其中，1 号峰为绿原酸，3 号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，6 号、8 号峰来源于岗梅，7 号峰为橙皮苷，9 号峰为蒙花苷。

图3 各成分HPLC 色谱图

图5 特征峰归属分析图

2.6 特征峰相对保留时间规定值 根据10 批清热祛湿颗粒特征图谱中9 个特征峰的相对保留时间（以9 号峰蒙花苷为参照峰），并结合方法学考察各因子对特征峰相对保留时间的影响，制定其规定值波动范围在±5%以内，分别为1.000（9 号峰）、0.202（1 号峰）、0.226（2 号峰）、0.461（3 号峰）、0.620（4 号峰）、0.639（5 号峰）、0.701（6 号峰）、0.782（7 号峰）、0.989（8 号峰）。

3 讨论

本实验对供试品溶液进行190～400 nm 全波长扫描，选择有强吸收者进行检测，发现在220 nm 处色谱峰数较多，分离度和峰形较好，最终确定其作为检测波长。

对流动相进行选择时，先考察甲醇梯度洗脱，结果基线不稳，所以更换乙腈。再考察了乙腈-0.1%硫酸、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.05%硫酸，表明以乙腈-0.4%磷酸洗脱时特征峰信息量较丰富，故选用其作为流动相。

本研究建立了清热祛湿颗粒HPLC 特征图谱，标定了9个共有特征峰，指认了1 号峰为绿原酸，3 号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，7 号峰为橙皮苷，9 号峰为蒙花苷，6 号、8 号峰来源于岗梅，并以蒙花苷（S 峰）作为参照峰，并规定了其他特征峰相对保留时间比值的范围。

综上所述，该方法简便高效，可靠，稳定性好，可较为全面地反映了清热祛湿颗粒化学成分，用来评价该制剂质量，以期弥补现行质量标准不足，完善相关评价体系。