甲基麦冬黄烷酮A 降低缺氧复氧诱导PC12 细胞凋亡及氧化损伤

赵 晶，李彦杰*，周厚勤，任 锟，邢若星

（1.河南省中医院康复科，河南 郑州 450002； 2.郑州大学第三附属医院康复科，河南 郑州 450052）

缺血性脑血管疾病是一种全球范围内严重威胁人类生命的重大疾病，当血流量减少或受阻时，大脑的氧气和营养物质不足，导致缺血性中风［1］。目前随着溶栓治疗的开展和应用，阻塞的血管能够再通，使脑组织恢复足够的血流，挽救了一些患者的生命，但是在血流增加时可能导致部分患者脑组织结构和功能发生异常，进而加重病情。大脑缺血再灌注可能诱发神经元损伤，其涉及到的机制主要有钙超载、氧化应激和神经细胞凋亡等［2］。

麦冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL 是百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，其块根有生津解渴、润肺止咳之效。麦冬的有效成分主要有甾体皂苷、高异黄酮、氨基酸和多糖等。其中甾体皂苷和高异黄酮是麦冬的主要活性成分，具有抗疲劳、清除自由基、抗炎、抗血栓形成、抗肿瘤等作用［3-4］。本研究以PC12 细胞株为研究对象，建立缺氧复氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）损伤模型，给予甲基麦冬黄烷酮A（methylophiopogonanone A，MO-A）处理，通过评价细胞活性、细胞凋亡及氧化损伤考察MOA 对PC12 细胞缺氧复氧损伤的作用，为MO-A 在脑血管疾病中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12 细胞株购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640 细胞培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco 公司；MO-A 购自上海融禾科技有限公司；CCK-8 细胞活性检测试剂盒、LDH 细胞毒性检测试剂盒、BrdU 细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；caspase-3 活性试剂盒购自美国Biovision 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehydc，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche 公司；caspase-3 抗体和β-actin 抗体购自英国Abcam 公司；辣根过氧化酶二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 PC12 细胞接种于96 孔板中，培养于含有10% FBS 及1%青霉素／链霉素的RPMI1640 培养基中，放入37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合度达到80%时，进行传代。此外，采用DMSO 配制浓度为50 mmol／L 的MO-A 母液，分装保存，使用时采用细胞培养液按照细胞分组稀释至实验浓度。

细胞分为5 组：（1）对照组，正常条件下培养PC12细胞；（2）模型组，PC12 培养在低糖RPMI 1640 培养基，置于5% CO2、95% N2、37 ℃的培养箱中培养4 h，更换为正常培养基后置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养24 h，建立H／R 损伤模型；（3）1 μmol／L MO-A＋模型组，采用1 μmol／L MO-A 预处理 1 h，进行 H／R 处理；（4）10 μmol／L MO-A＋模型组，采用10 μmol／L MO-A 预处理1 h，进行H／R 处理；（5）50 μmol／L MO-A＋模型组，采用50 μmol／L MO-A 预处理1 h，进行H／R 处理。

1.2.2 CCK8 测定细胞活性 细胞接种于96 孔板中，每孔加入100 μL 培养基，各组给予相应的处理，实验结束时，每孔加入10 μL CCK8 溶液，于37 ℃反应2.5 h，以650 nm为参考波长，采用酶标仪在490 nm 处测定吸光度（A），细胞存活率按照以下公式计算：存活率＝［（A实验-A空白）／（A对照－A空白）］×100%。

1.2.3 LDH 释放测定 细胞接种于96 孔板中，各组给予相应的处理，实验结束前1 h，弃培养基，加入110 μL（含10 μL LDH 释放试剂），于37 ℃孵育1 h，在多孔板离心机中400×g离心5 min，移取上清液至新培养板，按照说明书进行测定。

1.2.4 BrdU 掺入量测定 细胞接种于96 孔板中，各组给予相应的处理，按照BrdU 试剂盒说明书测定细胞中BrdU掺入量。

1.2.5 Cell Death Detectioin ELISA 测定细胞凋亡 细胞接种于24 孔板中，各组细胞给予相应的处理，实验结束后裂解细胞，提取细胞核，按照说明书进行检测。

1.2.6 caspase-3 活性测定 细胞接种于6 孔板中，各组给予相应的处理，实验结束后按照说明书测定caspase-3活性。

1.2.7 SOD、CAT 活性测定 各组细胞给予相应的处理，实验结束后收集细胞，按照说明书对SOD、CAT 活性进行测定。

1.2.8 MDA 水平测定 实验结束后，弃培养基，用PBS洗3 次，加入裂解液裂解细胞。12 000×g离心15 min，用BCA 蛋白测定试剂盒测定总蛋白量。根据该检测试剂盒的方向测定MDA 水平，结果以nmol／mg 蛋白表示。

1.2.9 蛋白印迹法 实验结束后，收集细胞总蛋白，采用BCA 法测定各组样品的蛋白浓度，每孔上样量50 μg，在SDS-PAGE 上进行电泳，目的蛋白分开后，200 mA 转膜1.5 h，以5% 脱脂牛奶室温封闭1 h，4 ℃过夜孵育抗caspase3、β-actin 蛋白，室温孵育二抗1 h，加入发光液，进行显色。

1.3 统计学分析 通过SPSS 11.0 软件进行分析，数据以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MO-A 对细胞活性的影响 PC12 细胞给予不同浓度（1、10、50 μmol／L）MO-A 处理24 h 后，考察MO-A 对细胞活性是否有影响。如图1A 所示，不同浓度MO-A 对细胞活性无明显作用，与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）。BrdU 测定细胞增殖结果如图1B 所示，与对照组比较，MO-A 处理组细胞增殖率无变化（P＞0.05）。由此表明，MO-A 对PC12 细胞活性及增殖无明显作用。

图1 MO-A 对细胞活性及增殖的影响

2.2 MO-A 降低缺氧复氧诱导的细胞活性损伤 细胞给予不同浓度（1、10、50 μmol／L）MO-A 预处理1 h 后，进行缺氧复氧损伤，通过测定细胞活性、细胞增殖及LDH 释放评价MO-A 对缺氧复氧损伤的作用。如图2A 所示，与对照组相比，模型组细胞活性降低（P＜0.05），MO-A 处理组细胞活性较模型组升高（P＜0.05），且呈现剂量依赖性。与模型组比较，1、10、50 μmol／L MO-A 处理均可促进细胞增殖（图2B，P＜0.05），且50 μmol／L＋模型组细胞增殖率最高。上清液中LDH 释放能够反映细胞损伤程度，如图2C所示，模型组LDH 释放率较对照组升高（P＜0.05），MO-A预处理LDH 释放减少（P＜0.05），呈一定剂量依赖性。

2.3 MO-A 降低缺氧复氧诱导的细胞凋亡 通过检测细胞凋亡率、caspase-3 活性及c-caspase-3 蛋白表达水平评价MO-A 对细胞凋亡的作用。如图3A 所示，与对照组比较，模型组细胞凋亡率升高（P＜0.05），给予MO-A 处理后，细胞凋亡率降低（P＜0.05），且50 μmol／L 处理组最低。MO-A 处理后，PC12 细胞caspase3 活性较模型组降低（图3B，P＜0.05），且呈现剂量依赖性。此外，与模型组比较，MO-A 处理组c-caspase3 蛋白表达降低（图3C，P＜0.05），呈剂量依赖性。由此表明，MO-A 能够抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡。

图2 MO-A 抑制缺氧复氧诱导的细胞损伤

图3 MO-A 降低缺氧复氧诱导细胞凋亡

2.4 MO-A 降低缺氧复氧诱导氧化损伤 通过检测SOD、CAT 活性及MDA 水平评价PC12 细胞的氧化损伤。如图4所示，与对照组比较，模型组SOD、CAT 活性降低，给予MO-A 处理后升高（P＜0.05），有一定剂量依赖性。此外，缺氧复氧损伤导致MDA 水平增加（P＜0.05），而MO-A预处理组降低（P＜0.05）。由此表明，MO-A 能够降低缺氧复氧诱导PC12 细胞的氧化损伤。

3 讨论

近年来，有多种天然产物在脑缺血相关疾病中发挥保护作用，如三七皂苷Rg1［5］、白藜芦醇［6］和芍药苷［7］等。麦冬作为一种常用的中药材之一，在多种疾病中具有保护作用，其有效成分麦冬多糖具有抗急性心肌缺血［8］及减轻脑缺血损伤［9］的作用。MO-A 作为麦冬中另一有效成分，能够减少心肌缺血再灌注损伤［10］。但是MO-A 对PC12 细胞缺氧复氧损伤的作用尚未报道，本研究中，考察MO-A对缺氧复氧诱导的细胞活性、凋亡及氧化损伤的作用。

首先，单独给予MO-A 处理PC12 细胞考察MO-A 对细胞活性是否有损伤作用，结果显示，MO-A 对细胞活性及增殖无明显作用。在H／R 损伤模型中，MO-A 预处理降低细胞损伤，表明MO-A 对PC12 细胞缺氧复氧损伤具有保护作用。有报道显示，MO-A 抑制心肌细胞系H9C2 细胞活性降低［10］。

许多研究表明，脑缺血再灌注导致神经细胞细胞凋亡，进而影响大脑正常的功能，引起不可逆的损伤，因此，减小或阻碍神经细胞凋亡对脑缺血再灌注损伤具有重要的意义。在心肌缺血再灌注损伤模型中，MO-A 显著降低心肌细胞凋亡，且MO-A 通过降低血脑屏障通透性保护脑组织缺血再灌注损伤［11］。本研究发现MO-A 预处理降低细胞凋亡率和caspase3 活性、并抑制c-caspase3 蛋白表达，且呈现剂量依赖性，表明MO-A 能够抑制PC12 细胞凋亡，减少缺氧复氧损伤。

图4 MO-A 降低缺氧复氧诱导氧化损伤

氧化应激广泛参与了许多病理生理过程，如衰老、炎症及肿瘤发生［12］。大量证据表明，ROS 过度生成引起的氧化应激是脑缺血再灌注发生发展的重要机制。因此，降低氧化应激被认为是治疗缺血性脑卒中的关键机制［12］。MOA 已被证实能够降低ROS 的产生［11］。本实验发现，MO-A预处理可抑制PC12 细胞SOD 和CAT 活性的降低、并对抗MDA 水平的升高，提示MO-A能减轻缺氧复氧损伤后神经细胞的氧化应激。

综上所述，MO-A 对缺氧复氧诱导PC12 细胞损伤具有保护作用，这与其抗凋亡及抗氧化的活性有关，本研究为该成分在缺血性脑病防治中的应用提供了新的思路和方法。