龙胆泻肝汤对阴道加德纳菌的体外抑制作用

吴 汉，敖梅英，陈雪丽，陈 来，左爱仁，谢燕飞，邓可众

（江西中医药大学中医学院转化医学中心，江西 南昌 330004）

细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）是阴道内正常菌群失调所致的一种混合感染，具有发病率高［1］、易复发［2］、危害大［3］等特点。阴道微生态正常情况下以各种乳酸杆菌为主，它们可以大量产酸、产过氧化氢气体，维持阴道酸性环境，抑制有害细菌的生长。BV 患者体内以阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis，GV）为首的厌氧致病菌通过黏附阴道上皮细胞、产生致密生物膜，分泌细胞毒素等作用使乳酸杆菌不能正常生长而大量死亡，最终造成阴道微生态菌群环境紊乱［4］。临床上常用药物为甲硝唑、替硝唑、克林霉素等，虽然治愈率理想，但复发率高，易耐药［5］，不适合孕妇等特殊人群［6］。大量文献报道，传统中药复方，如龙胆泻肝汤［7-12］、完带汤［13-14］、治带方［15］等在BV治疗及预防复发中具有确切疗效，但相关作用机制并不明确。龙胆泻肝汤是中医治疗湿热带下的经典方，上可泻肝胆之火，下可清利湿热，除口服外还可用药渣作用于局部，以起到燥湿杀虫之功效。本实验旨在研究龙胆泻肝汤对GV 的体外抑制作用，为该方临床应用提供理论依据和指导。

1 材料

1.1 试剂与药物 按照《医方集解》原方比例从北京同仁堂药店购买龙胆泻肝汤方剂原料药；哥伦比亚血琼脂平板（北京陆桥技术股份有限公司，批号171108）；BHI 肉汤培养基（英国Oxoid 公司，批号12276545）；革兰氏染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20150414）；DMEM 培养基（美国HyClone 公司，批号AC10206284）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号1743263）；胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司，批号20170315）；MTT（上海铺镇生物有限公司，批号298-93-1）；TRIzol（美国Ambion 公司，批号3596026）；qRTPCR 反转录试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司，批号AK4901］；SYBRII 荧光定量试剂［宝日医生物技术（北京）有限公司，批号AHX1020N］。

1.2 细菌与细胞 GV 为标准株ATCC14018，购于上海北诺生物有限公司。阴道卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus，LC）由南昌大学魏华教授馈赠，分离于健康女性阴道分泌物，经API 细菌学鉴定；Hela 细胞为本实验室保存。

1.3 仪器 MarkII 厌氧工作站（荷兰Mark 公司）；DM2500 普通光学倒置显微镜（德国徕卡公司）；Thermo 3001 多功能全波长酶标仪（美国Thermo Scientific）；Thermo 3110 二氧化碳培养箱（美国Thermo Scientific）；Light Cycler96 荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）；RE601 旋转蒸发仪（上海雅马拓科技贸易有限公司）；SW-CJ-2D 超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

2 方法

2.1 龙胆泻肝汤各部位的制备 龙胆泻肝汤水提物：按方称取组成药材，6 倍量水浸泡6 h，大火煮沸0.5 h 后小火煎0.5 h，滤过，重复2 次，合并滤液，离心后收集上清液，减压干燥至恒重。龙胆泻肝汤70%（95%）醇提物：按方称取组成药材，6 倍量70%（95%）乙醇浸泡6 h，70%（95%）乙醇回流提取3 次，滤过，合并滤液，离心后收集上清液，减压干燥至恒重。

2.2 稀释法测定龙胆泻肝汤各部位对GV 的最低抑菌浓度 按2 倍稀释法，用BHIs 培养基（称取BHI 固体培养基3.7 g，加入100 mL 去离子水，120 ℃高压灭菌，临用前加入10% 胎牛血清、1 mg／L两性霉素B）配制龙胆泻肝汤各部位提取物，初始浓度为500 mg／mL（生药），药物质量浓度从高到低（500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.907、0 mg／mL）设置。每管加入BHIs 培养基、GV／LC（接种量约为1×104CFU／mL）和不同浓度药物。培养管在37 ℃、5% CO2下培养48 h后，各取200 μL 加入96 孔酶标板中，酶标仪测OD600，每组样品均设置2 个复管。为了去除培养基和药物颜色对菌体吸光值检测的干扰，给药组数值均减去了培养基和各浓度下药物的吸光值（药物浓度越高，其自身吸光值也越高）。

2.3 革兰氏染色法观察药物对GV 黏附人宫颈癌Hela 细胞的影响 将灭菌的细胞爬片放置于细胞培养的6 孔板中，按每孔8×105个数量接种Hela细胞，用DMEM 完全培养基（含10% 胎牛血清）培养过夜。根据抑菌实验的结果，选用的药物为龙胆泻肝汤70%乙醇提物。从冻存管中复苏GV，按1%的比例接种于5 mL 培养管中，设置3 组，分别为BHIs 组、BHIs ＋1.56 mg／mL 药物组、BHIs ＋15.6 mg／mL 药物组，37 ℃、5% CO2下培养48 h，8 000 r／min 离心5 min，用DMEM 完全培养基稀释各组GV，以MOI（菌／细胞）＝10 的比例加到细胞培养孔中，37 ℃、5%CO2下培养4 h，PBS 洗涤3 次，将未黏附的菌体清洗干净，4% 多聚甲醛固定10 min，按照革兰氏染色试剂盒步骤进行染色，光学显微镜油镜下观察。细胞黏附于细胞表面的黏附率评分：未黏附，－；黏附1%～25%，＋；黏附25%～50%，＋＋；黏附＞50%，＋＋＋。

2.4 MTT 法检测药物对GV 细胞毒性的影响 取GV 冻存管，以1% 接种量转接至2 只5 mL 培养管，37 ℃、5% CO2下分别用BHIs 培养基和含药（15.6 mg／mL 龙胆泻肝汤70%醇提物）BHIs 培养基培养48 h 后，8 000 r／min 离心5 min，用DMEM完全培养基将菌体混悬至相同浓度（1×106CFU／mL）备用。取细胞培养用96 孔板，按每孔1×104个数量接种Hela 细胞，培养过夜。将上述BHIs 培养基和含药BHIs 培养基培养的GV 分别按照MOI＝1 和MOI＝10 的比例加到Hela 细胞中，分别培养1、2、3、4 h 后PBS 洗涤2 次，吸去上清，每孔加入100 μL 1%MTT，37 ℃、5%CO2下放置4 h 后，每孔加入分析纯DMSO 100 μL，酶标仪测OD490，每个样品设置有5 个复孔。

2.5 96 孔微量板法检测药物对GV 生物膜形成能力的影响 96 孔微量板法检测细菌的生物膜形成能力是被广泛应用的一种方法［16-17］，细菌形成生物膜以后，与含有明胶的培养板结合紧密，不易被冲洗掉，结晶紫染色后可呈现更深的着色。取细胞培养用96 孔板，每孔加入100 μL 0.1% 明胶，37 ℃放置4 h，小心吸去上清，备用。分别用BHIs 培养基、含药（1.56、15.6 mg／mL龙胆泻肝汤70%醇提物）BHIs 培养基配制GV 悬液，终浓度为1×107CFU／mL。将上述GV 按0.2 mL／孔接入明胶包被的96 孔板中，每个样品设置4 个复孔，37 ℃、5%CO2下培养60 h 后PBS 洗涤3 次，置于无菌超净台中吹干，每孔加入100 μL 甲醇固定30 min，弃去甲醇后每孔加入1%结晶紫，染色生物膜5 min，将96 孔板置于水龙头下均匀冲洗，晾干后每孔加入200 μL 33%冰醋酸，全波长酶标仪测定OD590。

2.6 荧光定量PCR 检测药物对GV 中生物膜相关蛋白（biofilm associated protein，BAP）和唾液酸酶（sialidase）基因表达的影响 BAP 是一种巨大的细胞壁锚定黏附素，可同时介导与宿主细胞的黏附及细胞间黏附，对生物膜的形成起着重要作用［18］。sialidase 是GV 分泌的细胞毒性物质之一，能降解阴道粘液，直接损伤阴道上皮细胞。

设置对照组（GV ＋BHIs 培养基）、BHIs ＋1.56 mg／mL药物组（GV＋BHIs 培养基＋1.56 mg／mL 龙胆泻肝 汤70% 醇提物）、BHIs ＋1.56 mg／mL 药物组（GV ＋ BHIs 培养基＋15.6 mg／mL龙胆泻肝汤70%醇提物）。将过夜生长的GV 按1∶20 比例接种于5 mL 上述培养液中，厌氧环境下37 ℃静置培养24 h 后，用PBS 洗涤2次，转移到500 μL TRIzol 裂解液中。按照TRIzol裂解液说明书提取纯化各组菌体总RNA，并溶于含30 μL RNase-free 的水中，用Nanodrop one 对RNA溶液进行定量分析。吸取1 μg RNA，逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，按1∶100 比例稀释后取2 μL cDNA 溶液作为模板，利用试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTM）进行荧光定量PCR。内参为菌体16sDNA 片段，对应的上下游引物分别为Gv16sc正向5′-AGGTACACTCACCCGAAAGC-3′，反向5′-CACATTGGGACTGAGATACGG-3′；BAP正向5′-GTGTCATTGAGCACACTTGC-3′，反向5′-GTTGTTAAAGAACACATCGAAG-3′；sialidase正向 5′-AGTCGCACTCCGCGCAAGTC-3′，反向5′-GACGACGGCGAATGGCACGA-3′，反应在Lightcycle96 仪上进行。采用2－ΔΔCt法进行数据处理。

3 结果

3.1 龙胆泻肝汤各部位对GV 的抑制作用 龙胆泻肝汤水提物、70%醇提物、95%醇提物对GV 的最低抑菌质量浓度分别为（62.5±3.6）、（15.6±1.5）、（125.0±2.8）mg／mL，而龙胆泻肝汤70%醇提物对阴道内LC 最低抑菌质量浓度为（62.5±1.6）mg／mL，远高于GV，见图1，说明它对GV的抑菌作用具有选择性。因此，后续实验选择龙胆泻肝汤70%醇提物、GV 进行实验。

3.2 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 黏附人宫颈癌Hela 细胞的影响 经龙胆泻肝汤70% 醇提物（1.56、15.6 mg／mL）共培养的GV 对Hela 细胞的黏附减少，见图2、表1，说明它能抑制GV 的细胞黏附能力，从而对细菌性阴道病起到积极的治疗作用。

3.3 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 细胞毒性的影响 GV 对Hela 细胞有较强的细胞毒性，与作用时间和MOI 值相关。随着GV 浓度增加，作用于Hela 细胞的时间延长，细胞毒性也增强。15.6 mg／mL龙胆泻肝汤70%醇提物共培养GV 后，Hela 细胞毒性减弱；MOI＝10 时与BHIs 组比较，15.6 mg／mL 龙胆泻肝汤70%醇提物作用4 h 后细胞存活率增加（P＜0.05）。见图3。

图1 龙胆泻肝汤不同提取部位对GV 和LC 的抑菌作用Fig.1 Bacteriostatic effects of different extractions of LXD on GV and LC

图2 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 黏附Hela 细胞的影响（×100）Fig.2 Effects of 70% ethanol extract of LXD on adhesion of GV bacteria on Hela cells（×100）

表1 龙胆泻肝汤70%醇提物处理后GV 对Hela 细胞黏附的评分Tab.1 Score for adhesion of GV treated with 70% ethanol extract of LXD on Hela cells

3.4 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 生物膜形成的影响 与BHIs 组比较，龙胆泻肝汤70% 醇提物（1.56、15.6 mg／mL）能抑制GV 生物膜形成（P＜0.01）。见图4。

3.5 龙胆泻肝汤70%醇提物对GVBAP、sialidasemRNA 的影响 与BHIs 组比较，龙胆泻肝汤70%醇提物（1.56、15.6 mg／mL）能降低GVBAP、sialidasemRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01）。见图5。

图3 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 细胞毒性的影响Fig.3 Effects of 70% ethanol extract of LXD on cytotoxicity of GV

图4 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 生物膜形成的影响Fig.4 Effects of 70% alcohol extract of LXD on biofilm formation of GV bacteria

4 讨论

龙胆泻肝汤是中医治疗湿热带下的经典方，本方以清上逆之实火、除下注之湿热的龙胆草为主，横冲直撞，荡邪外出；以清泄并举的黄芩、栀子为辅，清热以解百毒，泄火而利三焦；佐以泽泻、木通、午前子三味引火从小便而出，乃宗《内经》“在下者引而竭之”之意；当归、地黄养血柔肝，以防苦寒伤肝；柴胡为肝胆疏利之要药，甘草调和诸药。全方配伍臻妙，虽苦寒而不伤胃，祛邪兼收扶正固本，诸药合用，共奏清热利湿、扶正祛邪之功效。此方为临床治疗BV 的经典有效方剂，得到广泛应用［7-12］，兼有口服和局部熏洗，均有确切的疗效，但其有效部位和作用机制尚不清楚。

图5 龙胆泻肝汤70%醇提物对GV BAP、 sialidase mRNA 表达的影响Fig.5 Effects of 70% ethanol extract of LXD on the expression of BAP and sialidase mRNA in GV

GV 是兼性厌氧、革兰氏染色阴性、非运动、不定形态的小棒状菌，虽然在阴道pH 4～5 之间不生长，但它可以在此环境下黏附在阴道上皮细胞表面，形成致密的生物膜。生物膜在细菌性阴道病的发病过程中起着重要的作用，它既能够保护致病菌在不利环境下存活［19］，也能够抑制药物的渗入，使致病菌逃脱宿主的免疫攻击［20］，抗生素和宿主免疫都不能完全消除生物膜，这也是导致细菌性阴道病复发的主要因素［21］。此外，GV 还能释放一些细胞毒性物质，如细菌素、vaginolysins、唾液酸酶、蛋白酶等［22］，直接损伤阴道上皮细胞，并引起相关的病理反应。

鉴于临床上龙胆泻肝汤局部熏洗对细菌性阴道病有确切疗效，本研究考察了龙胆泻肝汤在体外如何影响GV 的增殖、黏附、生物膜形成、细胞毒性，这也是构成其致病性的主要四大因素。

结果表明，龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 具有较好的体外抑菌作用，最低抑菌质量浓度为（15.6±1.5）mg／mL，而对阴道卷曲乳杆菌的为（62.5±1.6）mg／mL，说明龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 具有选择性抑制作用，阐释了中药复方在治疗细菌性阴道病中“扶正祛邪”的作用机制。此外，龙胆泻肝汤70% 醇提物能抑制GV 黏附Hela细胞，从而减少它对阴道上皮细胞的“占位”，有利于阴道微环境中乳酸杆菌的定位与繁殖。细胞毒性实验表明，当MOI＝10 时，GV 能在4 h 内使Hela 细胞死亡率达到35.2%，而用15.6 mg／mL 龙胆泻肝汤70% 醇提物共培养后的GV 在同等条件下，Hela 细胞死亡率降低到19.4%，说明龙胆泻肝汤70%醇提物能够有效抑制GV 的细胞毒性。此外，1.56 mg／mL 龙胆泻肝汤70%醇提物能抑制GV生物膜的形成，可能是其治疗细菌性阴道病的主要机制之一。

然后，通过qRT-PCR 法测定了龙胆泻肝汤70%醇提物对GV 中BAP、salldasemRNA 表达的影响，其中前者能促进GV 生物膜形成，后者可增强GV 细胞毒性；1.56 mg／mL 龙胆泻肝汤70% 醇提物能显著抑制这2 个蛋白的转录，提示两者可能是药物作用的重要靶点。

本研究通过一系列体外实验阐述了龙胆泻肝汤70%醇提物抑制GV 的作用效果，为该方治疗细菌性阴道病提供了理论依据，并寻得了更有效的部位，同时对其作用机制进行了初步探讨。今后，将建立适当的动物模型，在体内进一步探讨龙胆泻肝汤作用机制及其对机体免疫系统的影响，并与体外实验相互佐证。