线粒体相关内质网膜在年龄相关性黄斑变性发病机制中的作用研究进展△

何美芹 韩国鸽 危平辉

内质网(endoplasmic reticulum,ER)和线粒体都是动态细胞器，能调节自身的结构和功能来适应外部环境的变化，以维持细胞内环境的稳态[1]。线粒体和内质网并不是孤立的，通过多个接触位点相互作用，这些接触位点形成线粒体相关内质网膜(mitochondrial-associated ER membranes,MAMs)或线粒体-内质网接触位点(mitochondria-ER contact sites,MERCs)。通过这些物理连接定位以蛋白质分子作为功能载体，形成强大的功能复合体。在MAMs平台上，2种细胞器的结构和功能可以联系起来，并且在生理及病理条件下相互调控相互影响，使复杂的细胞间物质信号生化信号交叉转导对话成为可能。目前，MAMs参与细胞内重要信号转导通路成为研究热点。研究显示，MAMs在许

多与年龄相关的神经退行性疾病的病理过程中起调控作用[2]。本文将分别从磷脂生物合成和运输、钙稳态、线粒体分裂和融合及自噬等几个方面进行综述，以阐明MAMs在年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)发病机制中的作用。

1 MAMs分子组成研究进展

研究发现，MAMs中存在不同的分子，但对这些分子的生物学作用至今仍未完全了解。例如，在酵母细胞中，连接ER和线粒体的蛋白质复合物结构称为ER-线粒体结构偶联复合物(ER-mitochondria encounter structure,ERMES)，据报道其含有Mdm12、Mdm34、Mdm10和Mmm1蛋白。Mdm12连接内质网膜蛋白Mmm1与线粒体外膜蛋白Mdm34或Mdm10[3]。这种物理上的关联建立了ERMES。哺乳动物细胞有更复杂的蛋白质复合物结构。Lee等[4]总结了在哺乳动物细胞中MAMs含有的复合物结构，包括MFN2-MFN1/2、BAP31-Fis1、 IP3R-Grp75-VDAC和PTPIP51-VAPB或PTPIP51-ORP5/8连接复合物，使2个细胞器紧密接触并相互影响。其他蛋白如PS2、PACS-2、Tespa1、SigR1、FUNDC1和MCU，均与内质网线粒体连接复合物有关。MAMs中发现的1212种候选蛋白中常见有：ACAT1、 BiP/GRP78、 calnexin、calreticulin、Erlin-1、Erlin-2、ERP44、HSPA9、MFN1、PDIA3、VDAC1、VDAC2和VDAC3。目前许多研究描述了MAMs蛋白在细胞生物学调控和衰老过程中的重要作用。MAMs在与年龄相关的神经退行性疾病病理生理中的作用越来越受到关注[5]。

2 MAMs与Ca2+稳态参与AMD

ER是细胞内Ca2+储存的主要部位，内质网的MAMs区富含1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R)。IP3R是位于ER膜上的肌醇三磷酸钙通道，调节内质网与线粒体之间的Ca2+流，并参与细胞分化、存活和细胞凋亡。Ca2+水平升高激活IP3R-Grp75-VDAC-MCU复合物，使Ca2+流入线粒体。IP3R 与电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)分别位于内质网膜和线粒体外膜，当连接蛋白GRP75降低时，线粒体Ca2+水平降低，GRP75通过与IP3R和VDAC相互作用，间接连接ER和线粒体，并且Grp75基因敲除可以防止线粒体中Ca2+过量导致细胞死亡，其中与IP3R-Grp75-VDAC-MCU复合物相关的蛋白可以调节ER与线粒体之间的Ca2+转移[6]。正常情况下，SigR1与BiP相结合。然而，当ER发生应激或配体激活时，SigR1与BiP解离，与IP3R相互作用导致Ca2+从ER流入线粒体[7]。其他MAMs中促进ER和线粒体之间有效Ca2+转移的蛋白包括Tespa-1、VAPB-PTPIP51和MFN复合物。此外，MAMs蛋白如PACS-2、Bid、Fis1、Bap31等参与细胞凋亡。由于不同水平的Ca2+可以分别触发能量的产生和细胞的死亡，因此MAMs对线粒体Ca2+水平的精细调节起关键作用。生理状态下线粒体Ca2+的上调激活Ca2+依赖的线粒体酶，促进TCA循环和氧化磷酸化，导致ATP生成增加。而线粒体Ca2+水平持续或过高则激活细胞凋亡通路。目前在神经退行性疾病中观察到MAMs的结构和功能缺陷[8]。ER与线粒体的对话增多在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病机制中起重要作用。在生理条件下，神经元内的ER-线粒体距离受到严格控制。当距离减小时，细胞质和线粒体均发生Ca2+超载。细胞质Ca2+超载除通过激活caspase途径外，还可促进β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)的产生和聚合，导致神经元细胞凋亡。线粒体Ca2+超载可导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成增加，线粒体通透性转化孔开放，最终导致神经元细胞凋亡[9]。 AMD与AD有类似的发病机制，其中Aβ是AD和AMD共同的病理特征[10]。以往组织病理学研究已经证实，软性玻璃膜疣包含Aβ。Shoda等[11]研究表明，软性玻璃膜疣面积可能是脑组织中Aβ积累的标志物。高浓度的Aβ诱导视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞死亡，并增加VEGF-A的mRNA的表达，Aβ-RAGE通路可能导致RPE细胞表达VEGF-A和PEDF。说明Aβ与脉络膜新生血管形成的发病机制密切相关。由此可见线粒体ER对话异常、Ca2+信号异常在干性AMD及干性转化为湿性AMD的发病机制中扮演重要的角色，但精确的作用机制有待进一步研究。

3 MAMs与磷脂合成和运输参与AMD

脂质中的磷脂是生物膜的重要组成成分，脂质合成主要在ER中进行，但仍需线粒体膜上酶的协同作用，因为ER与线粒体具有不同的脂质加工酶。线粒体可合成磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、心磷脂(cardiolipin,CL)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。但是磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)和磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)必须从ER转运。PS转入线粒体后，在线粒体内膜生成PE。通过MAMs将PS转移到线粒体中是PE生成过程中的限速步骤[12-13]。ER与线粒体的密切接触对脂质转运至关重要。最近研究发现，ORP5/ORP8定位于ER线粒体接触点，与线粒体外膜蛋白PTP1P5相互作用，将PS从ER转移至线粒体[14]。ORP5/ORP8的缺失导致线粒体形态和功能的改变。PC是线粒体的主要脂质，最近研究，发现StarD7可促进PC从ER转移到线粒体外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)。StarD7-I包含一个线粒体靶向序列，随后是一个跨膜区域，将蛋白质锚定在OMM上。C端START域随后延伸至细胞质，并在MAMs区域将PC从ER转运至OMM[12]。StarD7基因敲除后磷脂合成障碍，抑制StarD7促进内质网应激和诱导ROS产生[15]。研究表明，磷脂是视网膜光感受器中重要且高度富集的成分。AMD患者的Bruch膜中巨噬细胞和含磷脂的碎片共同定位。光照和高氧刺激会在眼睛中产生大量的氧化磷脂(oxidized phospholipids,oxPLs)，它们可以通过与视网膜RPE细胞和巨噬细胞结合，激活下游炎症级联而引发炎症反应。oxPLs还可能与补体因子H相互作用，参与AMD的发病机制[16]。免疫组织化学染色试验表明，氧化的PC存在于人类正常黄斑区的光感受器和RPE细胞中，其水平随年龄增长而增加。老年性黄斑变性的患眼对氧化磷脂的免疫反应比同年龄正常眼更强。据报道，oxPLs在AMD患眼中表达增加，并诱导小鼠脉络膜新生血管生成[17]。另一项研究表明，oxPCs可上调原代RPE细胞中VEGF的表达，这一使VEGF过表达的环节是AMD的关键病理过程[18]。根据以往的研究结果，磷脂是视网膜的重要结构和功能成分。它们可能在AMD的发病机制中发挥重要作用。然而，由于目前的进展主要处于实验室实验阶段，磷脂代谢与AMD之间的相关性仍需进一步研究。综上所述，这些发现表明，MAMs精细调节机制的失衡，造成磷脂合成和运输障碍，在衰老相关的神经退行性疾病中发挥重要调控作用，进一步了解其在AMD中的作用有助于发现AMD的危险因素和潜在的治疗策略。

4 MAMs与线粒体动力学参与AMD

线粒体动力学是指线粒体通过不断地融合与分裂以保持线粒体稳态。由线粒体分裂和融合蛋白精确调控完成，包括动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、线粒体融合蛋白1/2(mitofusin-1/2,MFN1/2)及视神经萎缩蛋白-1(optic atrophy 1,OPA1)等。线粒体动力学的调控与线粒体质量控制紧密相关，以保持线粒体的完整性和维持细胞内稳态。线粒体动力学在维持神经功能方面发挥重要作用，包括生物发生、线粒体分布和细胞损伤或死亡。MAMs促进线粒体融合和分裂的过程受一组蛋白MFN2、MFN1、DRP1、 Fis1或INF2调控，这些参与线粒体动力学过程的蛋白均位于MAMs[19]。DRP1、INF2和ER小管一起在线粒体周围形成收缩环促进线粒体分裂。线粒体分裂的主要蛋白DRP1在线粒体周围形成螺旋，形成一个收缩环，MFN2的突变使MFN2-MFN2相互作用失去功能，导致融合过程下降。MAMs通过破坏ER线粒体的接触，促进线粒体分裂。ER可能通过在MAMs处包围线粒体参与线粒体分裂，这一步依赖于肌动蛋白聚合，INF2基因突变可破坏线粒体收缩所需的肌动蛋白聚合步骤。Sig1R功能的紊乱扰乱了MAMs功能，Sig1R的缺失可以阻止线粒体分裂,使线粒体长度增加，线粒体动力学缺陷[20]。原位杂交表明，在RPE细胞中存在Sig1R mRNA。Sig1R可能在维持RPE细胞的稳态中发挥作用，RPE细胞功能失调促进AMD的发生和进展[21]。线粒体动力学异常参与了神经退行性疾病神经元退化的发病机制，此外线粒体动力学也受到线粒体钙水平的影响[22]。Alaimo等[23]首次报道光损伤导致RPE细胞线粒体动力学失调。A2E与蓝光一起触发RPE细胞凋亡，激活Caspase-3。蓝光和A2E负载和非负载ARPE-19细胞均能诱导线粒体融合/分裂失衡，导致线粒体破碎，与线粒体蛋白水平(OPA1、DRP1和OMA1)的失调节有关。ARPE-19细胞敲除OPA3后，应激纤维水平、细胞长度、细胞迁移和线粒体伸长显著增加。相反，ARPE-19细胞中加强表达OPA3，抑制了F-actin重排和诱导线粒体破碎[24]。研究线粒体动力学过程可能有助于研究AMD的病理机制。虽然MAMs中的蛋白质分子如何精确调控RPE细胞线粒体分裂和融合仍不清楚，目前的研究结果表明，MAMs参与的线粒体动力学的调控可能对视网膜退行性病变(如AMD)具有潜在治疗价值。

5 MAMs与自噬参与AMD

自噬，是一种真核生物进化上保留的细胞过程，需要内质网与线粒体等细胞器的相互作用以及共同参与。细胞内的成分包括受损的细胞器和聚集的蛋白质，被特殊的双层膜包裹称为自噬体，与溶酶体系统融合，从而促进其内容物的降解，产生代谢产物。这些代谢产物可被释放到细胞质中，循环利用。自噬是对RPE中持续存在的许多应激刺激发生反应，如缺氧、氧化应激、炎症或未折叠蛋白反应。此外，自噬发生在几乎所有细胞的基础水平，自噬的改变被认为是神经退行性疾病的原因之一。有证据表明，ER线粒体接触位点参与自噬小体的形成，MAMs中的许多蛋白对自噬囊泡的形成是必需的[25]。ER蛋白VAPB与线粒体外膜蛋白PTPIP51形成VAPB-PTPIP51复合物，作为支架连接两个细胞器。Gomez-Suaga等[26]研究发现，VAPB-PTPIP51复合物调节自噬，VAPB或PTPIP51表达增加以加强ER-线粒体紧密接触会抑制自噬形成，而siRNA介导的基因敲除抑制VAPB或PTPIP51表达使其接触疏松，促进自噬形成。MAMs区域被认为是自噬体的起源[27]。自噬蛋白在眼中高度表达，对神经视网膜和RPE细胞的健康均至关重要。包括RPE细胞在内的衰老细胞自噬失调会导致蛋白质聚集物的积累、细胞退化，最终导致细胞死亡。有证据表明，自噬流减弱会增加AMD的脂褐变和RPE细胞损伤[28]。当自噬能力随着ROS生成和蛋白聚集的增加而下降时，如RPE变性和AMD，它可能激活炎性小体，从而在视网膜细胞中引发低级别炎症反应，加速衰老过程。最近发现的线粒体自噬不仅被认为是一种自噬，而且是控制线粒体质量控制机制的一个重要和独特的部分。近年来随着对线粒体自噬的研究深入，认为线粒体自噬损伤可能在AMD的发病机制中发挥作用。线粒体自噬是RPE细胞对抗氧化应激的重要保护机制，可防止视网膜退化。位于MAMs区域的FUNDC1(FUN14 domain containing 1)是新发现的线粒体自噬受体蛋白。 Wu等[29]研究表明，FUNDC1是一种在缺氧条件下诱导线粒体分裂和线粒体自噬所必需的线粒体外膜蛋白，与ER 驻留蛋白CANX (calnexin)相互作用，随着线粒体自噬的进行，FUNDC1与CANX解离，更好地募集DNM1L/DRP1来驱动线粒体分裂，以应对低氧应激。在衰老细胞中发现线粒体自噬活性降低。衰老细胞中mTORC1活性升高，溶酶体超载可破坏自噬/线粒体自噬的终末事件，导致了脂褐素在溶酶体内的积累，是AMD的一个标志[30]。随着年龄增长，RPE细胞线粒体衰退，生物能量缺陷，抗氧化防御下降，对氧化应激的敏感性增加。此外，研究还发现，尽管恒河猴以及捐赠者人眼的RPE细胞中线粒体数量减少，但是其长度随年龄增长而增加。因此，线粒体的伸长与代谢/氧化应激有关。另外，拉长的线粒体形成平行的团簇，这些团簇垂直于细胞基底膜。在干性AMD患者中，已观察到与线粒体功能障碍相关的黄素蛋白荧光升高[31]。这些发现进一步表明，年龄相关的线粒体自噬导致的功能障碍可能参与AMD的发病机制。

6 结语

视网膜组织代谢活跃，RPE细胞、ER和线粒体发挥各自的功能，并相互制约，MAMs作为交叉对话的关键部位，在RPE细胞正常功能的维持及病理条件下RPE细胞功能异常，促进干性AMD发生及干性向湿性方向的转化方面的作用需进一步深入研究。随着对ER线粒体交叉对话机制研究的深入，其在AMD治疗靶点上将会有突破，在预防和治疗黄斑变性方面意义重大。