肠道菌群介导的非酒精性脂肪性肝病发病机制研究进展

高明月，杨雅坤，殷雅楠，崔清卓，张秀，赵京山*

1锦州医科大学辽宁省人类表型组重点实验室，辽宁锦州 121001；2河北中医学院药学院，石家庄 050200

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积为特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关[1]。肝脂肪变性被视为NAFLD的良性开始，该阶段没有明显的肝损伤，但部分肝脂肪变性患者会发展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其相关的肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2-3]。目前，研究人员致力于验证引起肝脏“双重打击”的假设[4]：导致NAFLD形成的“第一击”是指脂肪细胞中游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)的水平升高，肝脏中FFAs氧化水平降低，进而引起肝细胞中脂肪过度积累；“第二击”是指NAFLD患者中炎性细胞因子水平和氧化应激参数升高，从而对肝脏造成持续损伤。但大量研究表明，肠道菌群失调在人类肝病发病中起着重要作用，尤其是NAFLD及其相关的代谢紊乱[5]。人体肠道上皮的吸收面积达300～400 m2，定植约1014种细菌[6-7]，其多为共生微生物，依赖于饮食中的营养物质，同时处理难消化的物质，产生必需的代谢物，形成适应性免疫，以抵抗病原微生物的定植和入侵[8-9]，但这种相互影响的关系可能会因疾病表型而被破坏，进而导致肠道生态失调[10]。因此，肠道菌群失调被认为是NAFLD发病的关键因素，亦是NAFLD潜在的临床治疗靶点。

1 肠道菌群失调与NAFLD的关系

肠道内存在大量的微生物群，正常情况下各菌群比例和数量相对稳定，但宿主内外环境改变，包括饮食、酒精摄入、抗生素的使用和遗传因素等，可能导致肠道菌群失调[11-12]。NAFLD的主要危险因素(如饮食、肥胖和胰岛素抵抗)与肠道菌群密切相关，提示肠道菌群与NAFLD的病理生理机制密切相关。Le Roy等[13]将高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的肠道菌群移植入无菌小鼠体内，发现无菌小鼠发生NAFLD，表明肠道菌群在NAFLD发病中起着重要作用。Loomba等[14]分析86例经活检证实为NAFLD的患者[n=72，0-2期肝纤维化；n=14，3-4期(“晚期”)肝纤维化]的粪便微生物群发现，晚期肝纤维化患者的变形杆菌水平较高，而0-2期肝纤维化患者的厚壁菌门水平较高；晚期肝纤维化患者的37个(共40个)预测指标与肠道菌群相关。

尽管有研究支持NAFLD与肠道菌群失调的相关性，但最近的系统综述指出该结果具有一定局限性，如缺乏可重复性、未能阐明肠道菌群失调影响NAFLD的机制以及二者间的因果关系等。此外，多数研究的微生物组是从粪便中取样，但粪便的细菌组成与肠道菌群并不完全相同[15]。

2 NAFLD的微生物调节机制

2.1肠-肝轴 肝脏和肠道皆起源于腹前肠内胚层，两者在解剖学和生物学功能方面存在内在联系[16-17]。 肝脏和肠道通过门静脉相连，肝脏70%～75%的血液供应通过起源于肠道毛细血管的门静脉，与此同时，肠道中产生的一系列细菌、细菌代谢物和环境毒素可能通过门静脉到达肝脏[18]，致使肝脏成为肠道细菌及其衍生物最容易接触的器官之一。

肠道菌群与肝脏的共生关系是由一个相互作用的网络来调控的，该网络包括代谢、免疫和神经内分泌之间的相互作用。肠上皮的紧密连接是细菌及其代谢产物的天然屏障[19]。来自病原微生物或食物的抗原通过肠上皮的紧密连接被树突状细胞识别，或者通过调节T细胞反应来激活适应性免疫系统，而与病原体相关分子模式(pathogenassociated molecular patterns，PAMPs)如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖和鞭毛蛋白等通过Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和Nod样受体(Nod-like receptors，NLRs)激活核因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)，导致炎性细胞因子和趋化因子进入门脉循环；除了肝细胞损伤外，PAMPs还可激活参与纤维化进展的星状细胞，而Kupffer细胞对LPS的反应比星状细胞更强烈[20]。 肠-肝轴参与肝病的发病机制已成为当前临床研究的热点。

2.2微生物群对肠道屏障功能的影响 肠道上皮形成的紧密封闭的物理屏障主要由肠黏膜层和肠上皮细胞构成，上皮细胞间的连接复合体包括紧密连接、贴壁连接、桥粒连接和缝隙连接[21-22]。在生理条件下，紧密连接蛋白(如血带闭塞蛋白)在根尖处封闭相邻的上皮细胞，阻止细菌穿过肠黏膜进入血液循环[23]，部分研究将紧密连接视为肠通透性最重要的生理和病理调节因素之一[24]，但这种调节因素会随着紧密连接被破坏和细胞旁非自身抗原向固有层过度渗漏而变为病态。Li等[25]发现，肠黏膜炎症反应增强，肠上皮屏障被破坏，导致微生物产物易位，从而诱发NAFLD；Rahman等[26]发现，在缺氧和炎症刺激的病理条件下，紧密连接蛋白可产生收缩现象并向细胞质移动；而Hundertmark等[27]在2年后的研究中证实了细胞孔隙明显扩张，肠黏膜通透性增加，导致肠道细菌移位及其代谢物LPS通过门静脉系统进入血液和肝脏，刺激肝脏释放炎性因子，如肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-6。

2.3微生物群对肝脂肪变性的影响 Martinez-Castillo等[28]认为脂肪吸收受肠道微生物群(包括十二指肠微生物群)的影响，且脂肪吸收是肝脂肪变性的一个因素，一些效应分子与脂肪吸收等效应有关。

2.3.1肠道菌群-胆汁酸轴 原发性胆汁酸(bile acids，BAs)由肝脏合成并分泌至胆囊，进食后被释放至十二指肠，在肠道中被肠道细菌代谢为次生胆汁酸，然后被重新吸收入门静脉，大部分分子被肝脏捕获再循环，但有一部分仍留在血液中，充当信号分子。某些胆汁酸合成酶的表达受肠道菌群的调控，即胆汁酸的合成受肠道菌群的调 控[29]，因此，胆汁酸在NAFLD的发展中具有重要作用。Venetsanaki等[29]发现，NASH患者的粪便总胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸和胆汁酸的合成浓度高于健康对照组。

胆汁酸信号转导取决于被激活的受体，胆汁酸与其受体的亲和性各不相同，因此胆汁酸成分变化直接影响胆汁酸信号转导[30]。NAFLD最重要的胆汁酸受体为法氏X核受体(farnesoid X nuclear receptor，FXR；主要被初级胆汁酸激活)和跨膜G蛋白偶联受体5(transmembrane G-protein coupled receptor 5，TGR5；主要被次级胆汁酸激活)[31]。FXR是核受体超家族成员之一，在胆汁酸的肝脏吸收转运、新生肝脂肪生成、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)转运和三酰甘油(triglyceride，TG)代谢等过程中起关键作用。Watanabe等[32]发现FXR缺陷小鼠的肝脏TG和胆固醇含量升高。Takahashi等[30]研究NAFLD高脂饮食小鼠模型发现，通过调控肠道菌群使肠道细菌与FXR发生拮抗作用，会导致肝脂肪生成减少。FXR通过降低糖异生调节葡萄糖转运蛋白4的表达，降低肠道中胰高血糖素样肽1(GLP-1)的表达，以及增加肝糖原合成等调节葡萄糖稳态[33]。

总之，肠道菌群可能通过调节胆汁酸代谢引发NAFLD。FXR在NAFLD的发生过程中起关键作用，其可能成为治疗胆汁淤积、NAFLD引起的肝脏胆汁酸异常，以及脂质代谢疾病的靶点[34]。

2.3.2肠道菌群与短链脂肪酸 短链脂肪酸(shortchain fatty acid，SCFAs)是一种挥发性脂肪酸(如乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯)，主要由肠道微生物发酵可溶性膳食纤维和不易消化的碳水化合物产生[35]。 SCFAs在机体代谢中发挥多种作用，如调节食欲、促进能量消耗、刺激胰岛素敏感性以及激活肝脏和骨骼肌中腺苷单磷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)等，从而影响NAFLD的发展。SCFAs影响肝脏脂肪和脂肪组织积累的机制之一为通过G蛋白耦联受体43(G-protein-coupled receptors 43，GPR43)调节胰岛素敏感性，脂肪组织中GRP43被SCFAs激活，促进能量消耗，抑制脂肪组织和肝脏脂肪堆积，同时，肠道对SCFAs的识别可引起胰岛素增敏肽酪氨酸(peptides peptide tyrosine tyrosine，PYY)和GLP-1的释放，抑制胃肠蠕动，延长胃肠转运时间[36]。通过上述途径，肠道菌群及其代谢产生的SCFAs促进NAFLD的发生发展。

有研究探讨了SCFAs在肠道中的生理作用，但其在肝病中的作用尚未明确。Cortez-Pinto等[36]发现，NASH与低纤维饮食有关；Rocha等[37]发现，高纤维饮食的NAFLD患者血谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性和胆固醇水平有一定改善。此外，Schwiertz等[38]发现，超重和肥胖者粪便中丙酸盐含量更高，表明丙酸盐可能生产过剩或吸收被中断。SCFAs对肝脂肪变性的作用机制尚不明确，仍需深入研究。

3 肠道菌群参与NAFLD的发病机制

有研究表明，肠道菌群参与了NAFLD的发病，例如，Kaden-Volynets等[39]研究高热量饮食的无菌小鼠模型发现，与常规饲养的小鼠相比，高热量饮食喂养的无菌小鼠体重增加和脂质代谢受损，但肝脏无脂肪变性。此外，Martinez-Guryn等[40]发现，给无菌小鼠定植高脂饮食诱导的空肠菌群，即使食用低脂食物，其脂质吸收也增加，提示肠道菌群在触发代谢反应中起关键作用。此外，部分临床试验也在积极探索NAFLD与肠道菌群失调的因果关系，如Boursier等[41]比较了NASH患者与健康对照组的粪便菌群，发现两组粪便中的拟杆菌和普氏杆菌数量差异明显；类杆菌、NASH和瘤胃球菌与肝纤维化独立相关。由此可见，NAFLD的严重程度与肠道菌群的失调和代谢功能的改变密切相关，而目前的“多重打击”假说认为，多重打击共同作用于具有遗传易感性的受试者，从而诱发NAFLD。Ji等[42]分析肠道微生物源成分及其代谢产物，发现肠道微生物群在导致NAFLD发展的多重平行打击中发挥了重要的相互作用。Castaño-Rodríguez等[43]的研究表明，人类NAFLD与肠道通透性增加和小肠细菌生长有关，而后者可能是由肠内细胞间紧密连接破坏引起的。

综上所述，临床前的证据支持肠道菌群在NAFLD进展中的因果作用，但二者的因果机制尚未建立，因此，需要设计良好的、纵向的、前瞻性的队列研究，使用多组学分析技术，并辅以动物模型来解释复杂(和可能的多因子)的微生物群落与NAFLD宿主之间的相互作用[44]。

4 肠道菌群是NAFLD潜在的治疗靶点

微生物靶向治疗包括使用抗生素、益生菌(培养对人体健康有益的活微生物)、益生元(可发酵的膳食纤维，刺激益生菌的生长和生存)、合生菌(益生菌和益生菌的组合)和粪便移植等[45]。

4.1益生菌、益生元及合生菌 研究动物模型表明，益生菌、益生元和合生菌对肠道菌群具有明显的调节作用，通过改善脂肪代谢异常和肠道菌群失调，有助于NAFLD的治疗[46]。补充益生菌可调节炎性因子水平[47]，改善NAFLD的内脏脂肪、总胆固醇、胰岛素抵抗等代谢参数[48]；益生元主要是通过发酵成SCFAs来促进肠道细菌的生长[49]，相关的临床前研究表明其改善了NAFLD的生化和组织学各项指标水平[50]；合生菌是益生菌和益生元的结合体，是NAFLD治疗研究的一个新兴领域。Raso等[50]通过动物实验表明，大鼠经合生菌处理后，肝脏炎症和胰岛素抵抗均得到明显改善。

近年来，关于益生菌、益生元及合生菌的人体试验研究持续增多，初步证实了其在多种临床疾病中发挥着重要作用[51]。Ahn等[52]以合生菌(包括鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、戊酸乳杆菌、帕拉卡塞乳杆菌、布雷夫和双歧乳杆菌)作为对照药进行了为期12周的随机双盲试验，结果显示，治疗期间，肥胖患者的BMI和内脏脂肪面积明显减少，TG水平、肝内脂肪含量降低。特别的是，Parnell等[53]发现，超重和肥胖的成人在补充3个月的低果糖后，体重明显下降。Kellow等[54]对26项随机对照研究进行系统回顾发现，益生元可增强健康和肥胖个体的饱腹感、刺激胰岛素释放并维持餐后葡萄糖稳态。最近，Bomhof等[55]给予NASH患者低果糖作为对照药，进行了24周的随机双盲临床试验，首次发现益生元可对微生物组成进行组织学改良和修饰。Brett Bonnie等[56]的Meta分析发现，通过微生物治疗，肝脏酶、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、BMI、血清胆固醇和TG水平明显降低，未引发炎症反应。按治疗类别进行亚组分析发现，益生菌和益生元对BMI和肝脏酶的影响相同，但对总胆固醇、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)和LDL的影响不同。总之，益生菌、益生元及合生菌在NAFLD治疗中发挥着重要作用，对NAFLD的长期调控具有重要意义。

4.2抗生素 抗生素对NAFLD的作用机制是多因素的，可能包括肠道菌群组成、细菌毒性和(或)细菌代谢功能的改变，尽管每种抗生素的具体作用途径不同，但在小鼠模型中，服用抗生素鸡尾酒 (杆菌肽、新霉素和链霉素)后观察到NAFLD得到改善[50]。

在临床试验方面，Gangarapu等[57]研究了利福西敏短期(28 d)疗程对肝损伤免疫激活和内毒素血症标志物的影响，表明利福西敏与NASH患者的BMI轻度下降以及血清ALT、AST、丙种谷氨酰胺转移酶、LPS和铁蛋白水平明显下降有关。另一项研究发现，在利福西敏治疗后，NAFLD患者的转氨酶水平和NAFLD肝脂肪评分明显降低[58]。而Ponziani等[59]发现，利福西敏对NASH的治疗效果甚微。这种差异可能是药物剂量低、治疗时间短和样本量小引起的。特定的抗生素可以促进益生菌(如双歧杆菌和乳酸菌)的生长，从而对肠道菌群产生积极的影响。虽然短期抗生素治疗可能效果显著，但长期使用可能引发细菌耐药性，从而限制了药物疗效，增加了继发感染的风险[60]。因此，不鼓励长期使用抗生素。

4.3粪便微生物移植(fecal microbial transplantation，FMT) FMT是将健康供体的肠道微生物群通过消化道途径移植入患者体内，以恢复患者肠道微生物的多样性[61]。FMT在我国有1500多年的历史[62]，其中4例与1958年粪灌肠治疗假性膜性结肠炎有关[63]， 目前这种方法已被证实有效。根据2013年的指南，FMT被确认为一种治疗艰难梭菌反复感染的临床技术[64]，疗效已达90%[65]。到目前为止，在临床实践或已发表的研究中，尚未有证据表明FMT会在NAFLD、NASH和肝硬化病例的治疗中增加不良事件[66]。但是，这些初步结果需要包括不同病因和复杂肝硬化阶段在内的更大规模的临床试验来验证。Nistal等[67]将较瘦捐赠者的肠道细菌移植到NASH患者体内，6周后，患者胰岛素敏感性明显升高，产生丁酸盐的肠道微生物群水平升高。FMT可能为肝病患者提供更多治疗模式，但仍需深入研究进行验证。此外，关于FMT对人类健康产生有益影响的证据不足，更多临床试验正在研究FMT对NAFLD和NASH并发症的影响。总之，FMT被认为是NAFLD患者的一种治疗工具，许多研究结果揭示了FMT的潜在作用及其减轻NAFLD及NASH的可行性。

5 总结与展望

肠道菌群与肝病关系密切，在NAFLD、纤维化进展、肝硬化、肝癌等慢性肝病的发病中起重要作用。胆碱缺乏、SCFAs和BAs代谢等炎症通路与NAFLD和NASH有关。肠道微生物群与NAFLD发展相关的机制可能为进一步研究和治疗NAFLD提供潜在靶点，如以胆碱代谢和炎症为靶点的通路，但由于转基因的复杂性，确定肠道菌群在NAFLD发生中的具体作用具有挑战性。以往研究多采用16S rRNA测序，分辨率较低，仅局限于种属水平，因此利用高度精确的宏基因组测序在菌株水平上识别NAFLD相关微生物势在必行，同时宏基因组研究不能仅局限于物种和基因丰度的分析，还应该关注基因内容的变化，如单碱基突变、插入删除以及结构变化等。目前已有研究者提出对宏基因组进行单核苷酸多态性的研究，笔者认为，如能在大规模样本下比较分析NAFLD患者与健康人群肠道微生物组基因组水平的变化，寻找NAFLD相关微生物组单核苷酸多态性模式，将对揭示微生物组与肝硬化的关系提供全新的视角，为相关疾病的诊断和治疗提供新的依据。微生物组学研究为NAFLD的研究及临床治疗提供了新思路，未来转基因技术有望成为治疗肠道功能失调相关疾病的一项新技术。