RANKL基因rs9594738位点与贵州燃煤污染型地氟病的相关性*

田薇， 李鸣， 喻艳琴， 张秀秀， 王婵娟， 张婷， 单可人，官志忠， 何燕*

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004)

燃煤污染型地方性氟中毒(简称燃煤污染型地氟病)是由于氟污染地区居民使用高氟煤而污染环境介质或食物，从而引起以氟斑牙和(或)氟骨症为主要特征的一种慢性全身性疾病[1-2]。氟骨症是地氟病最严重的临床症状之一，主要表现为骨硬化、骨软化及骨质疏松等症状[3-4]。有研究表明，氟骨症的发病机制与骨的形成有极大的关系[5]，而核因子κB受体活化因子配体(receptor activatiw of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)具有调节骨代谢的作用，其在巨噬细胞克隆刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)存在的前提下与破骨细胞膜上特异性受体RANK结合，启动对破骨细胞的分化、成熟、活化的调节过程，抑制破骨细胞的凋亡，从而加速并增强骨吸收的过程[6-8]。多年来，陆续有研究报道了RANKL基因多态性与骨的形成相关疾病有关[9-10]，如王希丹等[11]研究发现RANKL基因的 rs9594738位点与髋部骨强度相关，Hsu 等[12]研究发现RANKL基因的 rs9594738位点与骨质疏松有相关性，但目前RANKL基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与地氟病关系的研究尚未见报道。本研究旨在通过分析RANKL基因rs9594738位点在贵州燃煤污染型地氟病病区地氟病患者及对照县人群中的多态性分布，探讨该位点的多态性与燃煤污染型地氟病的关联性，为燃煤污染型地氟病的发病机制、预防和治疗提供一定的依据和线索。

1 对象与方法

1.1 对象

参照《地方性氟中毒病区划分标准》(GB17018-1997) 划分贵州省地氟病病区。在知情同意原则下，按照简单随机抽样原则，在贵州省毕节市典型燃煤污染型地方性氟中毒病区采样(统称为疾病组)。疾病组根据地氟病的严重程度分为地氟重症组(地氟病病区有氟骨症且氟斑牙明显患者)130例，男35例、女95例，平均年龄(59.49±11.61)岁；地氟轻症组(地氟病病区仅有氟斑牙患者)235例，男80例、女155例，平均年龄(52.38±14.48)岁。以黔南布依族苗族自治州长顺县的样本 235例为对照组(无氟污染地区无地氟病症状人群)，男94例、女141例，平均年龄(48.75±16.97)岁。

1.2 方法

1.2.1模板标化 从实验室-80 ℃冰箱中取出样本全血基因组DNA，使用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite对全血基因组DNA定量后，标化至3 mg/L。

1.2.2基因分型 采用TaqMan-MGB 实时荧光定量PCR法对RANKL基因rs9594738位点进行基因分型。PCR反应总体系为10 μL，其中3 mg/L DNA溶液1.0 μL，TaqMan genotyping Master MixⅡ 3 μL，rs9594738探针 0.15 μL，加无菌ddH2O补足至10 μL；PCR反应条件为60 ℃ 30 s，95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，循环40次， 60 ℃ 30 s结束反应。采用Step One Software v2.3软件对扩增结果进行分析。完成检测后各种基因型随机抽取5%的样本进行测序验证，测序结果与分型结果100%相符。

1.2.3测序验证 从分型结果中将不同基因型随机各抽取5%样本送生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证。测序引物为上游5′- GCCTGTGGCTTGTGGGTAT-3′,下游 5′-TCTCTGATGTTTGTGGGGGA-3′。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析，采用χ2检验检测研究对象rs9594738位点的基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡以及SNP的等位基因、基因型频率在各组间的分布差异、性别分布差异；利用SNPStats在线软件对RANKL基因rs9594738位点进行遗传模式分析，包括共显性遗传模式(Codominant model)、显性遗传模式(Dominant model)、隐性遗传模式(Recessive model)、超显性遗传模式(Overdominant model)和加性遗传模式模(Log-Additive model)，并根据赤池信息量准则(akaike information criterion,AIC) 和贝叶斯信息准则(bayesian information criterions,BIC) 数值的大小来确定SNP位点的最优遗传模式，即AIC和BIC数值同时取最小值时的遗传模式。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RANKL基因分型

人基因组RANKLrs9594738位点的荧光定量PCR扩增曲线结果显示，RANKL基因rs9594738位点均有CC、CT及TT基因型，见图1；采用Step One Software v2.3软件对Real-time PCR扩增分析，结果显示RANKL基因rs9594738位点在地氟病人群和对照组人群中均存在C和T等位基因以及CC、CT、TT 3种基因型，见图2。

注：红线为CC野生纯合型，绿线为CT杂合型，蓝线为TT突变纯合型。图1 RANKL基因rs9594738位点TaqMan-MGB探针介导的实时荧光定量PCR扩增曲线Fig.1 RANKL rs9594738 TaqMan-MGB probe mediated real-time fluorescence quantitative PCR amplification curve

注：红点为CC野生型，绿点为CT杂合型，蓝点为TT突变纯合型，“X”为未确定。图2 RANKL基因 rs9594738位点基因分型Fig.2 RANKL gene rs9594738 locus genotypic results

2.2 测序验证

按照基因分型结果，随机从RANKL基因rs9594738位点各基因型样本中选取5%的样本进行测序验证(不足5例的基因型全部样本测序)，测序结果与TaqMan-MGB探针介导的实时荧光定量PCR基因分型的结果完全符合。见图3。

注：箭头所示A为TC杂合型，B为CC野生型，C为TT突变纯合型；红色为碱基T，绿色为碱基A，蓝色为碱基C，黑色为碱基G。图3 RANKL基因 rs9594738位点测序Fig.3 Sequencing of RANKL gene rs9594738 locus

2.3 RANKL基因 rs9594738位点的基因型频率和等位基因频率分布

各组人群RANKL基因 rs9594738位点的基因型频率和等位基因频率分布情况显示，地氟重症组、地氟轻症组人群分别与对照组人群的基因型频率分布构成比较差异无统计学意义(P>0.05)，地氟轻症组人群与对照组人群的等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05)，但地氟重症组人群与对照组人群的等位基因频率分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组人群RANKL基因rs9594738 位点基因型分布频率和等位基因频率分布Tab.1 Genotype and allele frequency distribution of RANKL rs9594738 locus in each group

注：(1)与对照组比较的χ2值。

2.4 RANKL基因 rs9594738位点基因型频率及等位基因频率分布的性别差异

基因频率及等位基因频率结果显示，各组人群RANKL基因 rs9594738位点基因型分布频率和等位基因频率分布的性别差异结果显示，地氟轻症组和对照组的基因型频率分布构成和等位基因频率的性别比较，差异无统计学差异(P>0.05)；但地氟重症组和对照组男女之间基因型频率分布构成和等位基因频率的性别比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组人群RANKL基因 rs9594738位点多态性分布的性别差异Tab.2 Gender differences in the polymorphism distribution of RANKL rs9594738 in each group

2.5 疾病组人群RANKL基因rs9594738位点的遗传模式

利用SNPStats在线软件对疾病组和对照组的RANKL基因rs9594738位点的等位基因进行遗传模式分析，结果显示RANKL基因rs9594738位点的最优遗传模式是超显性遗传模式，在该模式下C/T基因型与地氟病的发病风险无关(P>0.05)。见表3。

表3 疾病组和对照组人群RANKL基因rs9594738位点的遗传模式Tab.3 Allele and genotype distribution of RANKL rs9594738 in disease group and control group

2.6 地氟重症组人群RANKL基因 rs9594738位点的遗传模式

利用SNPStats在线软件对地氟重症组和对照组的RANKL基因rs9594738位点的等位基因进行遗传模式分析，结果显示RANKL基因 rs9594738位点的最优遗传模式是显性遗传模式，在该模式下C/T和T/T基因型增加了地氟病的发病风险(P<0.05)。见表4。

表4 地氟重症组人群和对照组人群RANKL基因 rs9594738位点的遗传模式Tab.4 Genetic pattern analysis of RANKL rs9594738 in severe fluorine group and control group

2.7 地氟轻症组人群RANKL基因 rs9594738位点的遗传模式

利用SNPStats在线软件对地氟轻症组和对照组的RANKL基因rs9594738位点的等位基因进行遗传模式分析，结果显示RANKL基因 rs9594738位点的最优遗传模式是隐性遗传模式，在该模式下T/T基因型与地氟病的发病风险无关(P>0.05)。见表5。

表5 地氟轻症组人群RANKL基因 rs9 594738位点的遗传模式分析 Tab.5 Genetic pattern analysis of RANKL gene rs9594738 in mild fluorine group

3 讨论

地氟病是一种严重危害身体健康的全身性疾病，分为饮水、饮茶和燃煤型氟中毒，临床主要表征为氟斑牙和氟骨症[13-14]。贵州是全国最严重的燃煤污染型地方性氟中毒病区[15]，官志忠等[16]研究发现贵州省燃煤型地氟病区主要分在贵州省的西部、西北部和北部，包括毕节市、六盘水市各县区。其中炉灶使用及其燃煤方式是贵州省燃煤污染型地氟病流行的主要因素，由于农村居民长期使用无排烟设施的炉灶，燃煤过程排放的含氟烟尘严重污染室内空气和食物，使生活在这一环境的人群因过量摄氟而引起慢性蓄积性氟中毒[17-18]。RANKL基因位于染色体13q14，RANKL蛋白包括317个氨基酸残基，成骨细胞、骨髓基质细胞和成纤维细胞等是其主要来源[19]。RANKL是破骨细胞增殖、分化和存活的关键[20]。有研究报道RANKL基因rs2277438位点多态性可能在骨重建过程中起着重要的作用[21]；Wang等[22]研究发现RANKL基因rs784870位点的CC型基因与OPG基因rs2073618位点的CC型基因是汉族乳腺癌患者使用芳香化酶抑制剂，导致骨密度降低的风险基因型；亦有研究表明RANKL基因的rs9594738位点的单核苷多态性与骨质疏松等骨骼疾病有关[23]。地氟病的主要症状之一是氟骨症，主要表现为骨硬化、骨软化及骨质疏松等症状，是在特定地理环境中过量氟暴露而引起的全身慢性蓄积性氟中毒[24-25]。已有研究表明RANKL基因的表达强度与氟骨之间存在正相关关系[26]，但目前对于RANKL基因在地氟病中的多态性研究报道较少。本研究结果显示地氟重症组人群等位基因频率分布与对照组人群相比差异有统计学意义(P<0.05)，从地氟重症组人群等位基因频率与对照组人群相比的结果来看，RANKL基因rs9594738位点多态性可能与氟骨症的发病有相关性，这与RANKL基因的表达和Ⅱ型骨质疏松具有相关性一致[27]。

地氟重症组和地氟轻症组人群RANKL基因rs9594738位点多态性分布的性别差异比较结果显示，地氟轻症组和对照组的基因型频率分布构成和等位基因频率的性别差异均无统计学意义(P>0.05)，但地氟重症组男女之间基因型频率分布构成和等位基因频率的性别差异均有统计学意义(P<0.05)。这一结果提示RANKL基因rs9594738位点在地氟重症组人群中男女之间的分布可能存在差异。对疾病组和对照组进行遗传模式分析，结果显示在最优遗传模式超显性遗传模式下，RANKL基因rs9594738位点的C/T基因型与地氟病的发生无关(P>0.05)，对地氟重症组和对照组进行遗传模式分析，结果显示在最优遗传模式显性遗模式下，RANKL基因rs9594738位点C/T基因型与T/T基因型可能与氟骨症的发生有关(P<0.05)。对地氟轻症组与对照组进行遗传模式分析，结果显示在最优遗传模式隐性遗传模式下T/T基因型与地氟病的发生无关(P>0.05)。

综上所述，本研究显示RANKL基因rs9594738位点多态性与贵州省毕节市地氟病区患氟骨症的可能有关，且其发病情况在男女之间可能存在差异；但是由于本研究样本量相对较少，容易产生统计偏差，因此还需要大样本量的研究进一步证实上述结果，从而进一步阐述RANKL基因rs9594738位点与地氟病的相关性。