PCSK9 基因5′UTR区rs45448095基因多态性与血浆LDL-C水平的相关性*

张营， 吴晟， 鲍海龙， 刘兴德

(1．贵州医科大学附院 心内科， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550025)

研究表明，血浆低密度脂蛋白(LDL-C)的高水平表达不仅仅影响冠心病，还可以增加缺血性脑卒中的风险[1-3]。全球人群中肥胖、高LDL-C以及相关疾病发病率、致死率越来越高[4-5]，降LDL-C治疗成为一个值得重视的问题。2003年关于家族性高胆固醇血症的大型全基因组关联分析(GWAS)的研究表明，前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是影响血脂代谢的关键基因[6]，其抑制剂可作为降低LDL-C药物被应用于临床。临床试验表明，不管单独应用、还是联合应用PCSK9抑制剂可降低45%～60%的LDL-C水平[7-8]。目前关于PCSK9基因非编码区的基因多态性与血浆LDL-C水平、以及冠心病风险的研究并不多，本研究对PCSK9基因5′UTR区基因多态性进行分析，探讨基因多态性与血浆LDL-C水平及冠心病风险的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象 96名于2014年5月-2015年10月来自武汉同济医院心内科住院冠心病患者为疾病组。冠心病诊断标准:(1)冠状动脉造影评估至少一段冠状动脉(右冠状动脉、旋支或前降支)>50%狭窄，(2)有典型的心肌酶学升高(肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌酸激酶)、典型心电图改变和临床症状，(3)有冠状动脉搭桥术或经皮冠状动脉介入治疗的病史；排除有先天性心脏病、心肌病、瓣膜病和肾脏或肝脏疾病，严重肿瘤病史的患者。选取同期96例空腹血脂(总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白)正常的体检者为对照组, 入选人群未使用降脂药物、重大疾病或病态肥胖(体质量指数>30 kg/m2)；疾病组患者和对照组均为汉族血统，并提供书面知情同意书，本研究获医院伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂 HEK293T细胞系、L02细胞由华中科技大学附属同济医院高血压研究所馈赠，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、dNTP、5×PrimeSTAR GXL缓冲液购自宝日医生物技术(北京)有限公司(takara中国)，引物由武汉天一辉远公司合成，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，pGL3-basic荧光报告基因载体购自武汉启动子生物有限公司，转染试剂Lipofectamine2000购自invitrogen公司，双荧光素酶报告检测试剂购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1标本采集及DNA提取 抽取疾病组及健康对照组人群外周静脉血2 mL，采用天根DNA提取试剂盒提取外周血白细胞DNA，放入-20°冰箱保存。

1.2.2信息学分析 使用千人基因组数据库(http://grch37.ensembl.org)分析中国汉族人群(han chinese in beijing, southern han chinese,共计208人)PCSK9 基因5′UTR区基因多态性。

1.2.3荧光报告基因实验 采用聚合酶链反应(PCR)从人DNA中扩增包含野生型等位基因(rs45448095-C)的362 bpPCSK9序列，其中Mlu1或HindIII限制性内切酶切位点分别位于5′和3′端，PCR产物经酶切后插入pGL3荧光素酶报告载体。利用携带突变等位基因的引物进行PCR重叠，得到包含rs45448095-T序列的突变载体(引物F为 GTCCGATGGGGCTCTGGTG, 引物R为GAGGGCCAGGGGAGAGGTT)。HEK293T细胞和L02细胞接种在24孔板中，带细胞密度至1×106细胞/孔时，将PGL3-T(rs45448095-T)或PGL3-C(rs45448095-C)400 ng与Renilla荧光素酶质粒50 ng共转染，37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞，用被动裂解缓冲液裂解细胞(Promega, WI, USA)，反复冻融3遍保证细胞充分裂解。使用荧光素酶活性发光计(SIRIUS, Pforzheim, Germany)测量荧光素酶的表达水平。每组选取6个副孔，重复3次独立实验。

1.2.4rs45448095位点检测 从人血DNA中扩增362 bp片段,采用Sanger法完成位点测序，方法参考文献[9]。Applied Biosystems 3130XL毛细管测序仪(applied biosystems,foster city,CA)分析PCR片段中荧光染料终结者循环产物；通过Chromas程序(technelysium Pty)鉴定了假定的多态性。结果由2名独立观察员证实。所有已鉴定的变异均经重复测序证实。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PCSK9基因5′UTR信息学分析

千人基因组数据库(http://grch37.ensembl.org)中显示中国汉族人群(包含中国北京汉族人和中国南方汉族人，共计208人)位于PCSK9基因5′UTR区上的SNP，只有一个常见SNP(Common SNP)，最小等位基因频率(MAF)>0.05，即rs45448095(MAF为 0.095)。

2.2 构建PCSK9基因5′UTR荧光素酶报告基因载体

PCSK9基因5′UTR编码序列全长约为362 bp( NM_174936.3)，经PCR扩增后，在2%琼脂糖凝胶电泳中显示362 bp处有明显的目的条带，电泳结果与理论结果一致，测序结果比对与原始序列吻合(图1)。

注：A为琼脂糖凝胶电泳结果，Marker为标准分子量参照物，1～3为PCR扩增样本；B为PCSK9 基因5′UTR区起始段DNA序列；C为PCSK9基因 5′UTR区终末段DNA序列。图1 琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序验证PCSK9基因 5′UTR区Fig.1 The PCSK9 gene was detected by agarose gel electrophoresis

2.3 基因多态性对 PCSK9 5′UTR活性的影响

在L02细胞中，PGL3-T(rs45448095-T)的荧光素酶活性较PGL3-C(rs45448095-C)显著降低(-54.1%±2.3%,P<0.000 1)，HEK293T细胞中PGL3-T与PGL3-C亦出现相同的变化(-47.6%±1.4%,P<0.000 1)。图2。

注：A为L02细胞，B为HEK293T细胞；(1)与PGL3-C比较， P < 0.000 1。图2 293T细胞和L02细胞中rs45448095C/T的荧光报告基因结果Fig.2 Luciferase assay of expression of PCSK9 5'UTR constructs carrying rs45448095C/T in LO2 cells and 293T cells

2.4 rs45448095测序结果

Sanger法测序可以明显分辨rs45448095基因多态性，见图3。对照组人群rs45448095频率为0.13，符合HW平衡；疾病组人群的rs45448095频率为0.115，符合HW平衡；2组人群的基因型分布差异无统计学意义(P=0.072)，见表1。

图3 rs45448095测序结果Fig.3 DNA sequences results of rs45448095

表1 两组人群的rs45448095基因多态性分布及等位基因频率比较Tab.1 The distribution of rs45448095 gene polymorphisms and their frequencies

2.5 对照组人群rs45448095不同基因型与血浆血脂水平关系

对照组人群的rs45448095不同基因型分布影响LDL水平，每一个基因型的改变，减少血浆LDL水平的风险的β(SE)为-0.353(0.158)，t=-2.237，P<0.05。不同基因型对血浆TG、TC、HDL水平无影响(P>0.05)，见表2。

表2 对照组人群rs45448095不同基因型对血浆血脂水平的影响Tab.2 Association of rs45448095 genotype with plasma lipid levels in control group

2.6 rs45448095不同基因型对冠心病相关危险度分析

对rs45448095基因多态性与冠心病风险进行分析。采用不同遗传特性模型分析结果显示,隐性模型(CC+CT vs TT)、显性模型(CC vs CT+TT)、加性模型(CC vs CT vs TT)，rs45448095基因多态性皆对冠心病风险无影响(P>0.05)，见表3。

表3 rs45448095不同基因型对冠心病风险的影响Tab.3 Association between rs45448095 variant with CHD

3 讨论

本研究结果显示，结合千人基因组计划数据库发现在中国汉族人群中常见的SNP(rs45448095)，对该SNP位点进一步进行简单功能验证，发现突变型(rs45448095-T)明显影响PCSK9基因的表达活性；这种影响不管是在肝细胞系(L02)中，还是肾脏细胞系(293T)中都存在；同样人群验证中，亦发现rs45448095-T可以减低血浆LDL-C水平，但并未影响其他血脂水平以及冠心病风险。

2003年发现PCSK9后，多项研究表明位于PCSK9基因码区上的错义突变、同义突变或多个突变组合的单体型都与血浆LDL-C水平强相关[10-11]。虽然没有过多的研究表明，这些突变是如何调节血浆LDL-C水平。但所有研究结果都证实，不管是PCSK9基因上的功能获得型突变还是功能缺失型突变都会影响LDL-C水平[6,12]。后续研究还发现低血浆PCSK9水平人群同样存在低血浆LDL-C水平[13]。由此可以认可PCSK9与血浆LDL-C的关系。鉴于此，研究工作者针对LDL-C代谢异常的患者研发了新的药物——PCSK9单克隆抗体、PCSK9抑制剂。与设想中一样，临床试验结果表明，抑制PCSK9后取得很好的降低LDL-C效果[14-15]。也有部分研究表明PCSK9上的突变在影响LDL-C后，可以影响冠心病或是缺血性卒中的风险[16-17]。虽然关于PCSK9上的基因突变与LDL-C的关系的研究很多，但大多研究都是位于编码区上的基因突变，关于基因领域研究新热点——非编码区上的基因突变未受到太多关注。而且深入探讨PCSK9基因突变影响血脂水平机制的研究不多，尤其是关于PCSK9可受什么调控继而影响LDL-C的研究并不多。越来越多的研究证实，非编码区上的突变是可结合调控因子继而对基因进行调控达到功能确实型或者功能缺失型突变，继而影响基因的变达和影响血脂水平亦或疾病风险[18-19]。

本研究发现首次证实，PCSK9基因5′UTR区的基因突变——rs45448095，是一个功能缺失型突变。细胞荧光报告基因实验显示rs45448095-T突变后明显减低了PCSK9表达活性，且在多个不同细胞系皆出现此结果。假设可能存在一个多组织高表达的调控因子可结合在此处调控PCSK9的表达，基因多态性破坏了这种结合。就像本实验研究者之前曾经证实的ChREBP基因3′UTR区基因多态性破坏了与miRNA的结合位点继而影响ChREBP的表达[9]。不过遗憾的是，本研究曾运用多种生物信息学的方法并没有预测到这个调控因子，无法证实实验假设。与此同时，人群研究表明rs45448095-T突变影响人群血浆LDL-C水平，未影响TG、TC及HDL-C水平。表明PCSK9上的功能缺失型基因突变主要降低人群血浆LDL-C水平，这与前人研究一致[20]。但不同于前人的是，本研究没有证实这种突变带来了LDL-C降低的突变可降低冠心病风险。不过鉴于本研究的样本量过小、功能实验不够严谨，该研究无法充分证实rs45448095是否影响冠心病风险，rs45448095-T突变型是否具有类似PCSK9抑制剂的作用。后续仍需要更大的临床研究以及更多的功能实验证实研究者的假想。但本研究为后续研究提供了一个新方向，亦降脂治疗提供了一个新可能。

综上所述，PCSK9基因5′UTR区rs45448095基因多态性可以显著降低中国汉族人血浆LDL-C水平，本研究进一步证实了PCSK9表达与LDL-C的关系，可为PCSK9抑制剂的功效研究提供依据。