基于ITS序列的薄荷种质资源遗传关系鉴定研究

吴雯雯 （南通科技职业学院，江苏省南通市 226007）

薄荷是唇形科薄荷属多年生宿根性草本植物，全草可入药，被广泛用于中医药领域，也是世界著名的香料植物，具有较高的药用、食用和工业价值。全世界薄荷属植物有30种、140多个变种，分布于美国、印度、日本等[1]。薄荷在我国各地也有广泛栽培，主要栽培于江苏、安徽、河南和江西等省，目前，我国的薄荷属植物有12种，其中野生种有6种[2]。

薄荷喜生长在溪边、河滩等潮湿地带，因长时间栽培，种间杂交情况普遍，故对其进行属内种间的鉴定较为困难[1]。传统的分类方法有形态学分类法和化学成分分析法，但这两种方法均有一定的局限性，其中，形态学分类法只能初步鉴定薄荷属不同植物种类，且在实际操作中易受人为观测误差的影响；化学成分分析法易受外界环境因子的影响[3]。近年来，随着分子标记技术的发展，DNA水平的标记因具有不受基因表达和环境影响的优点，被广泛应用于遗传多样性分析[4]。例如，谢琳等[5]利用ISSR分子标记技术对引种到海南的14个薄荷种质资源进行了遗传多样性分析，并将其分为六大类；陈小华[6]利用AFLP分子标记将收集到的28个薄荷品种分为七大类。同时，随着分子鉴定技术的发展，DNA条形码技术随之产生，DNA条形码鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，具有鉴定速度快、可重复性强、不受内外因子影响等优点，是传统鉴别方法的有效补充[7]。例如，陈士林等[8]推荐将ITS2作为药用植物通用条形码，并建立了一套鉴别技术体系。目前，DNA条形码鉴定法在石斛、两面针、矮地茶等药材的识别和遗传关系分析上已取得了一定的进展[9-11]，但利用该技术对我国薄荷主栽品种进行遗传分析的报道较少，仅有庞晓慧等[12]利用ITS2序列对薄荷及其相关种进行了鉴定分析。为此，本研究基于ITS序列，对收集到的11个薄荷种质进行了遗传关系分析，以期为发展DNA条形码技术、分析薄荷遗传关系和开发利用薄荷优良品种提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用来自9个物种的11个样本，分别为圆叶薄荷[Mentha rotundifdia(Linn.) huds]、胡椒薄荷-01（Mentha piperita-01）、胡椒薄荷-02（Mentha piperita-02）、美国薄荷（Monarda didymaL.）、香水薄荷（Mentha arvensis）、苹果薄荷（Mentha suaveolens）、留兰香（Mentha spicataLinn.）、欧薄荷[Mentha longifolia(Linn.)huds]、亚洲薄荷-01（Mentha asiatica-01）、亚洲薄荷-02（Mentha asiatica Boriss-02）、柠檬薄荷（Mentha citrata），编号依次为M1-M11。上述11个薄荷种质资源引种地点见表1，所有材料经鉴定后栽种于南通科技职业学院园艺苗圃基地内。

1.2 试验方法

1.2.1 仪器和试剂

主要仪器：PCR仪（ABI verity），离心机（Eppendorf 5415D），DYY-6C电泳（北京六一仪器厂），dycp-31dn电泳槽（北京六一仪器厂），Bioses SC 760凝胶电泳图象采集仪（上海山富科学仪器有限公司），37 ℃恒温培养箱（VWR公司），超净工作台（苏州净化设备厂）。

表1 11个薄荷种质资源信息统计

主要试剂：基因组DNA提取试剂盒（南通麦杰生物技术有限公司），Taq DNA聚合酶/ pfu DNA聚合酶（南通麦杰生物技术有限公司），dNTPs（南通麦杰生物技术有限公司），DL2000 ladder（Takara公司）。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增和测序

称取薄荷叶片8 mg左右，置于研钵中，采用液氮速冻后，研碎叶片，然后采用植物DNA提取试剂盒提取薄荷基因组DNA。本研究根据植物保守区域设计扩增ITS序列所用的通用引物，正向引物为ITS-F:CCGTAGGTGAACCTGCGG，反向引物为ITS-R:GACGCTTCTCCAGACTA。PCR反应总体积为50μL。

反应体系：10M正反向引物各1μL，taq酶（5U/）1μL，10mM dNTP 1μL，基因组DNA 2μL，10×buffer 5μL，加双蒸水至50μL。

扩增程序：预变性95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，2 min；扩增40循环，周末延伸72 ℃，7 min；4 ℃保温；将PCR产物纯化后进行测序。

引物合成和测序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2.3 数据分析

采用SeqMan软件对测序结果进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得ITS全序列。利用软件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)5.0计算物种种内种间Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。应用最近距离法(Nearest Distance)、构建NJ(邻接)系统聚类树方法对薄荷进行遗传关系鉴定分析。

2 结果与分析

2.1 ITS序列

应用MEGA 5.0软件分析11条ITS序列，序列长度在576～709 bp，碱基A占碱基总数的18.75%，碱基T占碱基总数的30.84%，碱基C占碱基总数的16.49%，碱基G占碱基总数的33.90%，（G+C）的含量变幅为60.86%～67.47%，平均（G+C）含量为64.75%。所有序列经过校对后提交Genbank，获得的登录号见表1。

2.2 遗传距离分析

由表2可知，应用最近距离法分析薄荷各品种间遗传距离，其遗传距离为0.001～1.365，平均值为0.456 6。其中，美国薄荷和柠檬薄荷间遗传距离最大，为1.365，说明这两个品种间的差异较大，亲缘关系最远；圆叶薄荷、欧薄荷、胡椒薄荷-01、胡椒薄荷-02间遗传距离均小于0.007，表明这4个品种的亲缘关系较近，尤其是圆叶薄荷和欧薄荷间遗传距离很近，几乎为0，说明两者间的亲缘关系最近；苹果薄荷与柠檬薄荷间遗传距离为0.163，而这两个品种与其他品种间遗传距离均在1.0以上，说明这两个品种的遗传背景极其相似，亲缘性极为接近。

表2 11个薄荷种质资源K2P遗传距离

2.3 基于ITS的系统发育树

基于ITS序列，构建NJ(邻接)系统聚类树，见图1。NJ树显示，11个薄荷种质资源可分为三大类。第一大类包括美国薄荷、香水薄荷、亚洲薄荷（亚洲薄荷-01和亚洲薄荷-02）和留兰香；第二大类包括胡椒薄荷（胡椒薄荷-01和胡椒薄荷-02）、圆叶薄荷和欧薄荷；第三大类包括苹果薄荷和柠檬薄荷。从聚类分析结果来看，亚洲薄荷群体聚成一类，胡椒薄荷群体聚成一类，说明这些群体的遗传关系较近，且种内薄荷种质资源基本能聚合在一起。

3 结果与讨论

本研究利用ITS序列分析方法，对收集的11个薄荷种质构建了系统发育树。结果显示，11个薄荷种质资源可分为三大类；从聚类分析结果来看，两个胡椒薄荷品种聚为一类，说明这两个胡椒薄荷品种的遗传关系较近；本研究所采集的圆叶薄荷与留兰香不归在一类，这与预期有所差异，但这也显示了我国留兰香群体有较大的遗传多样性，这为今后留兰香新品种的培育提供了较大的可选择空间；香水薄荷和美国薄荷归为一类，这和谢琳等[5]的研究结果一致。综上，本研究选用ITS序列对11份薄荷种质资源进行遗传关系分析，基于ITS序列构建的NJ(邻接)系统聚类树分支明显，可有效分析薄荷属植物的遗传关系。

薄荷属植物在自然环境下生长容易发生变异，这有利于薄荷品种改良，但也造成了其遗传背景的关系[13]。基于序列分析的DNA条形码技术是目前影响较大、应用较广泛的DNA鉴定技术，能克服传统形态学分类方法和常用DNA分子标记技术的缺陷，具有可重复性良好、方法通用性强、可构建统一数据库和易于推广等优势。