任传忠, 肖 猛, 李 玮, 王红伟
(1信阳职业技术学院生理教研室, 信阳 464000; 2河南省人民医院神经内科, 郑州 450000; 3河南科技大学护理学院, 洛阳 471000)
帕金森病(Parkinson disease,PD)是世界上第2常见的神经退行性疾病,其典型临床表现为静态震颤、运动迟缓、僵硬和姿势异常[1]。虽然PD的主要神经病理学特征已被确定:含有α-突触核蛋白的Lewy小体过度累积导致黑质逐渐丧失多巴胺能神经元[2],但PD发生和发展的机制仍不清楚。现有的PD治疗手段只能部分缓解症状,几乎不能减缓多巴胺能神经元病变的进展[3]。因此,寻找更有效治疗PD的药物具有重要意义。
神经炎症的特征是神经胶质细胞(包括小胶质细胞和星形胶质细胞)的活化,并伴随着促炎分子[如白细胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)]以及氧化应激反应中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的增加[4]。PD的发病、进展与小胶质细胞活化密切联系[5],且有文献报道[6],在PD患者的活检显示纹状体和黑质中有活化的小胶质细胞积聚。因此,抑制小胶质细胞活化和神经炎症对PD具有治疗潜力。
α-硫辛酸 (alpha-lipoic acid,ALA)是一种抗氧化剂,同时具有水溶性和脂溶性的特征[7]。ALA可跨过血脑屏障,在大脑中可发挥抗氧化作用,具有改善痴呆的作用[8]。而ALA在PD中对神经影响的研究成果尚不明确。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-mothyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)是一种神经毒素,可通过损伤或破坏黑质中的多巴胺能神经元来诱发PD,并能在小鼠中引起典型的PD样症状[9]。因此,本研究通过注射MPTP建立小鼠PD模型,随后研究ALA对MPTP导致的运动缺陷、多巴胺能神经元损伤、小胶质细胞活化以及神经炎症的影响。
MPTP、ALA、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗体购自Sigma-Aldrich;放射免疫沉淀测定(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液购自Solarbio;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo;IL-1β抗体购自Novus;离子钙结合接头分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1)抗体、TNF-α抗体和COX-2 抗体购自Abcam;高效液相色谱仪、旷场实验全自动记录仪和转棒测试仪购买自Med Associates。
36只SPF级7~8周雄性C517BL/6J小鼠[(23±3) g],购自河南省实验动物中心[SCXK(豫)2017-0001]。实验动物均饲养在SPF级动物房中,小鼠可自由进食进水。所有实验开展前,小鼠均在饲养环境下适应一周。动物房室温(22±1) ℃,昼夜循环12 h。所有动物实验遵循我国《实验动物护理和使用指南》执行。
3.1小鼠帕金森模型及分组 小鼠适应饲养1周后,随机分为对照(control,Con)组、MPTP组和MPTP+ALA组,每组12只小鼠。MPTP组小鼠连续5 d腹腔注射MPTP(30 mg·kg-1·d-1),第6~9天腹腔注射相同体积生理盐水。MPTP+ALA组小鼠连续腹腔注射ALA(100 mg·kg-1·d-1)9 d,其中前5 d在注射MPTP(30 mg·kg-1·d-1)前2 h给药。对照组连续9 d每天注射相同体积生理盐水。其中每组2只小鼠用于中途评估模型构建情况。本实验最终纳入每组10只小鼠进行统计。纳入统计的小鼠在第10天进行后续研究。
3.2旷场实验 造模结束后,用全自动旷场记录仪进行旷场实验。小鼠在实验环境中适应1 h,然后将小鼠放置在旷场中央,记录小鼠在30 min的时间运动的总距离和平均速度。记录仪在工作时,实验环境无人。
3.3悬绳实验 造模结束后,将每组小鼠进行悬绳实验。小鼠在实验环境中提前适应1 h,然后将小鼠前肢放在水平铁丝中间(直径2 mm,长50 cm)。悬挂的小鼠倾向于用后后肢支撑,以避免摔倒并沿着铁丝网走到平台上。记录180 s间摔倒和到达次数,分数计算公式参考文献[10]。
3.4转棒实验 造模结束后,将每组小鼠进行转棒实验。在240 s的记录时间内,以0.1 r·min-1·s-1的加速度从4 r/min开始恒定加速。每只小鼠进行3次,每次间隔40 min,计算3次掉落的平均时间。
3.5小鼠脑组织分离及切片 造模结束后,麻醉每组小鼠,快速解剖并收集完整脑组织,脑组织分为两部分,一部分在冰上快速分离出纹状体并储存在-80 ℃下。另一部分脑组织在4 ℃下固定于4%多聚甲醛中过夜;然后依次采用20%和30%蔗糖溶液中脱水,用OCT包埋,-20 ℃冷冻24 h后,使用冷冻切片机连续切割获得小鼠脑组织切片(8 μm),并将其保存在-80 ℃下。
3.6免疫组化染色 每组小鼠脑片在0.6%的H2O2浸泡45 min后,PBS洗涤2次。然后脑片用0.2% Triton X-100通透30 min,接着置于10%山羊血清中,在37℃下封闭1 h。随后采用I抗(TH 1 ∶1 500)在37℃条件下孵育2 h后,再4℃孵育过夜。次日,脑片用II抗(1 ∶200)在37℃条件下孵育1 h。随后用AB过氧化物酶(1 ∶200)染色45 min,最后以DAB溶液显色。在显微镜下随机拍摄5个视野,通过ImageJ软件统计阳性信号。
3.7免疫荧光实验 每组小鼠脑片在室温下用0.2% Triton X-100通透30 min,随后用10%山羊血清在37 ℃下封闭1 h,然后在37 ℃下孵育I抗(TH 1 ∶1 500, Iba-1 1 ∶1 000)2 h后再4℃孵育过夜。次日,洗去I抗后滴加荧光II抗(1 ∶500),室温孵育1 h。DAPI(1 ∶1 000)室温孵育30 min后,在荧光显微镜下观察并随机选取5个视野,通过ImageJ软件统计阳性信号。
3.8高效液相色谱 每组小鼠纹状体在0.4 mol/L HClO4中匀浆,随后在11 050×g下4 ℃离心15 min,收集上清液。上清液经BCA检测蛋白浓度后,将上清液加入色谱仪中,采用高效液相色谱仪测定多巴胺(dopamine,DA)及其代谢物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)的含量。DA与DOPAC的含量表示为ng/g蛋白。
3.9免疫印迹实验 用RIPA裂解液裂解每组小鼠脑组织并提取总蛋白后,用BCA法定量蛋白浓度。用RIPA裂解液调整蛋白浓度至一致(300)后,取同样体积蛋白样品电泳。电泳后,将蛋白质电转移至甲醇预活化的PVDF膜,100 V、2 h。转模结束后以5%脱脂牛奶室温下封闭1 h,I抗(β-actin 1 ∶1 500,TH 1 ∶1 500,IL-1β 1 ∶1 000,TNF-α 1 ∶1 000,COX-2 1 ∶1 000 ) 孵育2 h后后4 ℃过夜。第2天,以TBST洗涤,室温孵育HRP标记的II抗1 h,TBST洗涤后成像显影。胶片进行扫描后,以β-actin为内参照,用凝胶图像处理系统分析目标条带的相对吸光度值。
3.10TH阳性细胞计数 每只小鼠脑片以Bregma点为基准收集2.80~3.64 mm 6个切片,用DAB法进行TH染色。在显微镜下通过Stereo Investigator软件统计TH阳性细胞总数。
3.11TH阳性细胞吸光度分析 每只小鼠脑片以Bregma点为基准收集-1.60~0.00 mm 4个切片,用DAB法进行TH染色,光学显微镜下用Image-Pro Plus 6.0 软件分析。在减去背景吸光度值后,计算每只动物所有切片的平均值。
数据表示为均数±标准误(SEM),使用SPSS 19.0软件对数据进行分析。组间均数比较采用单因素方差分析及最小显著性差异法。以P<0.05为差异有统计学意义。
在旷场实验中,与对照组比较,MPTP组小鼠的总移动距离和平均运动速度均显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠的总移动距离和平均运动速度均显著增加(P<0.05),见图1A、B。悬线实验结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠悬线实验的评分显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠的悬线实验评分显著增加(P<0.05),见图1C。转棒实验结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠下落潜伏期明显增加(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠下落潜伏期明显降低(P<0.01),见图1D。
Figure 1. Effect of ALA on motor deficits in MPTP-induced PD mice. A: statistical results of the total distance in open-field test; B: statistical results of the average velocity in open-field test; C: statistical results of the hanging wire test scores; D: statistical results of the falling lantency in rotarod test. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;*P<0.05,**P<0.01vsMPTP group.
图1 ALA对MPTP诱导的PD小鼠运动缺陷的影响
采用免疫组化方法检测黑质区TH阳性细胞数和纹状体TH阳性神经纤维密度,结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠黑质中TH阳性细胞数和纹状体TH阳性神经纤维密度均显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠黑质中TH阳性细胞数和纹状体TH阳性神经纤维密度均显著增加(P<0.01),见图2。
Figure 2. Effect of ALA on TH expression in substantia nigra and striatum after MPTP treatment. A: representative immunohistochemical images for TH staining in the substantia nigra and statistical results of TH-positive cells; B: representative immunohistochemical images for TH staining in striatum and statistical results of TH-positive nerve fiber density. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
图2 ALA对MPTP处理后小鼠黑质和纹状体TH神经元的作用
Western blot实验显示,与对照组比较,MPTP组小鼠纹状体中TH表达显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠纹状体中TH表达显著增加(P<0.01),见图3A。高效液相色谱结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠纹状体中DA和DOPAC水平均显著降低(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠纹状体中DA和DOPAC水平均显著升高(P<0.01),见图3B、C。
Figure 3. Effect of ALA on dopamine (DA) release in striatum after MPTP treatment. A: representative Western blot images and statistical results of TH expression in striatum; B: the level of DA in striatum was detected by high-performance liquid chromatography; C: the level of DOPAC in striatum was detected by high-performance liquid chromatography. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
图3 ALA对MPTP处理后的纹状体多巴胺释放的作用
采用免疫组化和免疫荧光染色检测小胶质细胞标记物Iba-1阳性细胞进行了小胶质细胞的活化研究。结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠纹状体和黑质中中Iba-1阳性细胞数均显著增加(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠纹状体和黑质中Iba-1阳性细胞数均显著降低(P<0.01)。此外,MPTP小鼠脑组织中,小胶质细胞体积变大、分支也明显变多,细胞形态变化明显,尤其是MPTP处理后的黑质,见图4。
Figure 4. ALA inhibits MPTP-induced the activation of microglia in striatum and substantia nigra. A: representative immunohistochemical images for Iba-1 staining in striatum and statistical results of Iba-1 positive cells; B: representative immunofluorescence images for TH and Iba-1 colocalization staining in substantia nigra and statistical results of Iba-1 positive cells in dopaminergic neurons of substantia nigra. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
图4 ALA抑制MPTP诱导的纹状体和黑质中小胶质细胞活化
Western blot结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠纹状体中COX-2、IL-1β 和TNF-α的表达均显著增加(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠纹状体中COX-2、IL-1β 和TNF-α的表达均显著降低(P<0.01),见图5A。免疫荧光染色结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠黑质中小胶质细胞的iNOS阳性细胞数显著增加(P<0.01);与MPTP组比较,MPTP+ALA组小鼠黑质中小胶质细胞的iNOS阳性细胞数显著降低(P<0.01),见图5B。
Figure 5. Effect of ALA on cytokines in microglia induced by MPTP. A: representative Western blot images and statistical results of the expression levels of COX-2, IL-1β and TNF-α in striatum; B: representative immunofluorescence images for iNOS (red) and Iba-1 (green) colocalization staining (arrows) in substantia nigra and colocalization rate of iNOS and Iba-1. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
图5 ALA对MPTP诱导的小胶质细胞细胞因子的作用
PD是一种发病率仅次于阿尔茨海默病的神经退行性疾病,是全球第2大常见的神经退行性疾病[11],影响着约1%的60岁以上人群[12]。目前常用的PD治疗方案虽能减轻患者的症状,但并不能改善疾病进展[3]。因此,寻找更有效治疗PD的药物具有重要意义。
ALA临床上主要用于糖尿病多发性神经病及心血管损伤等糖尿病并发症的治疗[13],且ALA可跨过血脑屏障,在大脑中发挥抗氧化作用[8]。已有文献[14]在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)诱导的PC12细胞PD模型中,ALA能抑制6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡。在鱼藤酮诱导大鼠PD模型中,ALA能减轻鱼藤酮诱导的PD大鼠脑内氧化应激水平[15],这些结果提示ALA具有治疗PD的潜在作用。MPTP是PD研究中常用的神经毒素,可选择性损伤多巴胺能神经元并诱导动物的PD样行为[16]。本研究在MPTP诱导的PD小鼠中通过旷场实验、悬绳实验以及转棒实验证实ALA能抑制MPTP导致的运动障碍。PD的典型病理特征包括黑质多巴胺能神经元的丢失和纹状体区多巴胺能突触末端的丢失[2]。为确定ALA是否能保护多巴胺能神经元免受MPTP损伤,本研究结果表明,ALA能抑制PD小鼠黑质中多巴胺能神经元的丢失和纹状体中TH神经纤维密度降低,且能促进PD小鼠纹状体中DA和DOPAC释放。本研究提示,ALA能显著改善MPTP引起的PD小鼠多巴胺能神经元损伤。
目前研究普遍认为,源自小胶质细胞介导的炎症介质会加重PD患者巴胺能神经元退化的进展[4, 17]。小胶质细胞是一种存在于大脑的免疫细胞,在神经炎症过程中起着核心作用[18]。在PD早期,患者的大脑中小胶质细胞会发生慢性炎症[19],并且通过正电子发射断层成像证实了PD患者中持续激活的小胶质细胞[20]。活化的小胶质细胞促进促炎分子和活性氧的产生,使多巴胺能神经元更容易退化[17, 21]。因此,本研究检测了ALA对PD小鼠的小胶质细胞活化以及炎症因子的影响,研究结果表明,ALA能降低PD小鼠黑质和纹状体中反应性小胶质细胞活化,且,ALA能抑制PD小鼠纹状体中炎性因子IL-1β、TNF-α和COX-2的表达。另外,本研究还显示,ALA能降低PD小鼠黑质中小胶质细胞iNOS的水平。然而作为一种抗氧化剂,ALA在减少小胶质细胞中的抗炎作用机理还需要进一步解释。并且由于氧化应激是一个复杂的过程,ALA在氧化应激中的作用尚待深入研究。
综上所述,本项工作显示,ALA能降低MPTP诱导的PD小鼠的反应性小胶质细胞活化和神经炎症,减轻黑质和纹状体多巴胺能神经元退化并改善运动缺陷,在MPTP诱导的PD小鼠模型中发挥神经保护作用。