混合陈旧断骨的尸源鉴定1例

（北京华大方瑞司法物证鉴定中心，北京 101318）

1 案 例

1.1 简要案情

2017年7月，本鉴定中心受某地委托，要求帮助赵某（男）和朱某（男）从40余块混合的陈旧断骨检材中找到亲属的遗骨。通过沟通了解到，在某湖的施工过程中，误挖出40余块陈旧骨骼，其中有赵某父亲（死于1967年）和朱某爷爷（死于1949年）的尸骨。

1.2 DNA检验

1.2.1 DNA提取

样本为45块骨骼样本（依次编为1～45号）、赵某血痕样本（编为46号）以及朱某血痕样本（编为47号）。用手术刀和超纯水清理骨骼样本表面，清洗干净后自然晾干。45块骨骼样本大部分为断骨，骨髓腔内充满泥土，长短不一（7～28 cm），大部分表现为中空、手感轻、硬度低、韧性差，部分骨骼可轻易折断。

用电钻钻取骨骼样本较厚的部位获得骨屑。骨骼DNA的提取纯化采用MagAttract M48 DNA Manual试剂盒（德国Qiagen公司，简称M48试剂盒）。各样本取2g骨屑分别置于50mL离心管中，加入1000μL消化液 Buffer G2（德国 Qiagen公司）、300 μL脱钙液［0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA），pH=8.0］、200 μL二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）溶液（1 mol/L）以及200 μL蛋白酶K溶液（20 mg/mL），液面淹没检材，振荡混匀，将样本置于56℃恒温水浴摇床中消化，其间补加1次蛋白酶K溶液和DTT溶液。后续DNA提取纯化参照M48试剂盒说明书进行，用预热的洗脱液重复洗脱1次，洗脱体系为30μL。

赵某和朱某的血痕样本采用《法庭科学DNA实验室检验规范》（GA/T 383—2014）中的Chelex法提取DNA。

1.2.2 PCR扩增与STR分型

取上述DNA溶液为模板，依次采用GlobalFilerTMExpress PCR Amplification Kit（美国 Applied Biosystems公司）和Goldeneye®DNA身份鉴定系统26Y［基点认知技术（北京）有限公司］在9700型PCR仪（美国Applied Biosystems公司）上进行复合扩增，PCR产物经3500xL基因分析仪（美国Applied Biosystems公司）进行毛细管电泳，采用GeneMapperTMID-X v1.5软件进行基因型分析。

反应体系和操作程序均按照相应试剂盒说明书进行。

1.2.3 检验结果

2、11、15号骨骼样本中检出部分STR分型，46、47号血痕样本得到完整分型，2、11、15、46、47号样本在常染色体STR基因座的分型结果见表1。

11号骨骼样本和46号血痕样本在检出的20个常染色体STR基因座的分型结果均符合孟德尔遗传定律，经计算，累积亲权指数大于10000；11号骨骼样本和46号血痕样本检出的Y-STR分型结果一致，参照《亲权鉴定技术规范》（GB/T 37223—2018），支持11号骨骼样本所属个体与赵某（46号样本所属个体）为生物学父子关系。

参照文献[1-2]的方法，用ITO法计算2号骨骼样本与47号血痕样本的祖孙关系指数。基于ITO法，祖孙关系具有同源基因的概率（φ值）与半同胞关系一样，故用ITO法计算两个人的祖孙关系指数可参照半同胞指数（half sibling index，HSI）的计算。经计算，2号骨骼样本与47号血痕样本的祖孙关系指数大于19，倾向于认为2号骨骼样本所属个体与朱某（47号样本所属个体）为祖孙亲缘关系。同时，2号骨骼样本与47号血痕样本的Y-STR分型结果一致，不排除具有同一父系亲缘关系，可辅助判断上述结果。

表1 2、11、15、46、47号样本常染色体STR基因座的分型结果Tab.1 Typing result of autosomal STR gene locus of No.2，11，15，46，47 samples

2 讨 论

陈旧性骨骼样本受保存时间和环境因素的影响，骨骼中的糖蛋白等蛋白质可能和DNA产生亚甲基化学交联。DNA的氧化导致碱基的缺失或更迭，酸、碱催化作用都可导致碱基本身水解脱氨基，保存时间和环境等因素的影响可导致骨骼DNA严重降解[3]，因此如何提取高质量的DNA是骨DNA分析的关键。

随着DNA提取技术的发展以及提取经验的积累，骨骼DNA的提取方法多样并不断优化，骨骼DNA的提取不再是难题，尤其是保存时间在30年以内、保存状态完整的骨骼样本，DNA检出率高达90%以上[4]。本案例中，45块骨骼样本中仅检出3个样本的STR分型，推测原因为：（1）骨骼保存年限较长，为50年以上；（2）骨骼完整程度不佳，大部分为断骨，多表现为中空、手感较轻、韧性差等，这都为本案例骨骼的DNA提取工作增加了难度。检索文献[5-7]并结合现有的实验条件和检验经验，现对此类样本的提取方法总结如下：（1）增加骨屑用量，适当延长消化时间。因检材较陈旧，骨骼细胞中DNA降解严重，DNA提取纯化过程中会损失部分DNA，所以增加骨屑用量，延长裂解消化时间，可促使骨骼细胞中的微量DNA充分释放。（2）裂解消化与脱钙同时进行。人类骨组织细胞间质主要由胶原蛋白和羟基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］构成，EDTA作为一种螯合剂可螯合间质中起稳固作用的钙，从而破坏骨组织结构的稳定性，使骨骼中的DNA更充分地释放[6]。但是骨骼样本在脱钙过程中会导致部分DNA的流失，所以裂解和消化同时进行既可减少DNA的损失，又可节省时间，还可以减少操作步骤避免DNA的污染。（3）减少洗脱体积。本案例中使用M48试剂盒提取，洗脱体积为30μL，且用预热的洗脱液重复洗脱1次，可增加DNA获得率，有效提高DNA模板的浓度。

在峰图判型方面，单纯一次的实验结果并不可靠，李成涛等[8]也提出实验室工作人员对微量或高度降解的检材进行检测时须特别注意防止污染，对于某些重复性不好或杂峰较多的基因座，将不予采信。总之，微量检材的判型必须严谨、慎重。