东北天南星生物碱对草地贪夜蛾Sf 21细胞凋亡的影响

刘丽华，于 洋，白 岩，刘业辉，于凯歌，丁 宁

当前，由于使用化学农药引发的环境污染、残留、病虫害抗药性等问题，极大地威胁了人类本身及环境的安全.针对现今农业可持续发展理论，开发植物源农药是解决这些问题的关键性手段，利用天然植物活性成分创制新型、高效、低毒杀虫剂备受人们重视［1].长白山野生植物资源非常丰富，其中有毒植物资源种类繁多，达到160多种，它们能够产生生物碱、类萜、类黄酮、精油等多种性质各异的次生代谢物，在杀虫、抑菌等方面均有一定表现［2].长白山大多有毒植物在医药上被使用，少数在民间作为杀虫农药使用，极大地限制了长白山有毒植物的应用和开发.

东北天南星（Arisaema amurense Maxim.）属天南星科天南星属多年生草本植物，为常用中药，具有燥湿化痰、祛风止痉、散结消肿的功效［3].其化学成分以生物碱、黄酮类、多糖为主，另外还有氨基酸、脂肪酸及甾醇等成分［4].现代药理研究表明，生物碱具有显著的生物活性，是其重要的有效成分之一，具有抗肿瘤［5]、抗菌［6]、抗氧化［7]、昆虫毒杀［8]等作用.目前，对天南星的研究在化学成分和药理作用及机制等方面都有新的报道［9-10]，但在农业害虫生物防治方面，其杀虫机制未见报道.

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）也称秋黏虫，广泛分布于美洲大陆且迁飞能力较强的毁灭性农业害虫［11].草地贪夜蛾幼虫可取食玉米、水稻、小麦、棉花等300多种寄主作物［12].自2019年1月云南省首次发现该虫危害玉米以来，其发生危害地区逐渐扩大，目前已有20 多个省（区）发现草地贪夜蛾［13].鉴于草地贪夜蛾在我国扩散速度之快，潜在地理分布之广，危害作用之强，故以草地贪夜蛾Sf 21 细胞系为靶标，利用植物源杀虫剂对其杀虫活性及机制进行研究尤为重要.

为此，本文以显著杀虫活性的长白山有毒植物东北天南星为试验对象，通过现代提取分离手段制备其生物总碱，采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT 法）检测东北天南星生物总碱对离体培养草地贪夜蛾Sf 21 细胞毒性影响，并利用流式细胞仪检测对其细胞凋亡的影响，从而在细胞及分子水平上深入研究和揭示天南星毒性作用机制，以期为天南星科植物开发为植物源杀虫剂提供理论和实验依据.

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂

Sf 21细胞株由江苏大学生命科学学院惠赠.细胞培养基TC-100 及胎牛血清购自Invitrogen公司，MTT 购自华美生物工程公司，二甲基亚砜（DMSO）为Sigma 公司产品，Annexin V 细胞凋亡试剂购于美国Biolegend公司.东北天南星采自吉林省通化市头道沟，由通化师范学院植物组教研室鉴定确认.

1.2 方法

（1）东北天南星生物总碱的提取.称取东北天南星干燥的地下根茎50 g，采用甲醇浸提，减压蒸馏获得粗提取物，进一步分离出生物总碱，生物总碱的提取方法参考武刚毅等［14]的方法进行.用DMSO 溶解东北天南星生物碱，临用前用TC-100 培养液稀释成质量浓度为10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL的药液，置于4 ℃培养箱中备用.

（2）细胞培养.Sf 21 细胞用含体积分数10%胎牛血清的TC-100 培养基于27 ℃培养.2～3 d换培养基1次，细胞铺满培养瓶90%以上面积时应及时分瓶传代.

（3）MTT 法测定细胞抑制率.取对数生长期的Sf 21 细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，以100 uL/孔种入96孔培养板中，培养24 h后，各试验孔中加入东北天南星药液，使培养液中天南星终浓度分别为10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL，对照组加入100 uL 培养液，调零孔不加细胞，只加培养液.每组均设3 个重复，置于27 ℃培养箱中培养24 h、48 h、72 h后，弃去孔内培养液，各培养孔中加入80 uL培养液和20 uL MTT溶液（5 mg/mL）继续培养4 h，弃去孔内培养液，每孔加入150 uL DMSO，置微量震荡器低速震荡10 min，使形成的甲臜完全溶解，490 nm酶标仪检测各浓度的吸光值，计算抑制率的公式如下：

（4）流式细胞仪测定细胞凋亡率.Sf 21 细胞以2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，经不同浓度东北天南星作用48 h 后，采用Annexin V-FIFC/PI双荧光标记，根据凋亡试剂盒说明，用流式细胞仪分析Sf 21细胞凋亡情况.

（5）数据分析.图表采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，统计数据以xˉ±s表示，组间比较采用单因素方差分析.

表1 不同浓度东北天南星生物总碱对Sf 21细胞的抑制作用（xˉ±s）

2 结果与分析

2.1 东北天南星生物碱对Sf 21细胞增殖的影响

与对照组相比，不同浓度东北天南星生物总碱对Sf 21 细胞均有抑制作用，如表1 所示，并且随着处理时间的延长及药物浓度的增大，抑制率明显增加.50 ug/mL 剂量组在72 h 基本上不存在活细胞.提示药物作用具有明显的剂量和时间依赖性.

2.2 东北天南星生物碱对Sf 21细胞凋亡的影响

不同浓度的东北天南星生物总碱分别作用于Sf 21细胞48 h后，分别取各处理细胞经Annexin V-FIFC/PI 双染后，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果表明，与对照组相比，各剂量组均可诱导Sf 21 细胞发生凋亡，且随着东北天南星质量浓度（10 ug/mL、30 ug/mL、50 ug/mL）的增加，细胞凋亡率也逐渐增加，分别为18.4%、35.2%、62.5%.表明东北天南星诱导Sf 21 细胞凋亡作用呈剂量依赖性.具体细胞凋亡率如图1所示.

图1 不同处理条件下Sf 21细胞凋亡率

3 讨论

近年来，由于化学农药的弊端日益凸显（残留、抗性、环境污染），特别是环境保护和生态平衡问题，使化学农药受到严重挑战.对植物源杀虫剂的研究与开发是当前创新型农药研制的热点［15].东北天南星作为具有杀虫活性植物之一，对其细胞凋亡机制的研究有助于为把东北天南星开发为植物源杀虫剂提供理论与实验依据.关于东北天南星根提取物对细胞的毒性［16]和对细胞凋亡的影响［17-18]等已有一些报道，但对于昆虫细胞的毒性及细胞凋亡作用的研究还未见报道.

本研究中东北天南星对Sf 21细胞在实验质量浓度范围内抑制作用较明显，其细胞抑制率与药物浓度、作用时间呈剂量依赖性，即随着东北天南星药物浓度的增加，抑制率逐渐增加，随着作用时间的延长，抑制率也相应增加.这与汤建华［19]等用天南星醇提取液作用人胃癌细胞结果相同.

流式细胞仪检测了Sf 21 细胞凋亡情况，结果显示，东北天南星具有较强的诱导Sf 21 细胞凋亡的作用，随着药液质量浓度增大，细胞凋亡的比例明显增加，诱导细胞凋亡作用增强.由此可见，天南星生物碱可能是通过诱导昆虫细胞凋亡达到杀虫的目的，黄维林［20]等研究结果表明，肺癌A549细胞在天南星总黄酮作用下发生凋亡也与药物浓度呈剂量相关性.但由于昆虫细胞和癌症细胞理化性质的不同，其诱导凋亡的网络和途径也不同，因此对其凋亡机制研究还有待于进一步研究.同时，本文研究的是东北天南星生物总碱，今后将进一步分离纯化杀虫活性成分，明确各种活性成分的作用及相互关系，寻找具有农药活性的先导化合物，进而研制出新型植物源农药.