淮南猪线粒体DNA D-loop 遗传多样性及母系起源研究

徐秋良，段广莹，张 潇，朱宽佑，李婉涛，黄炎坤*

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046；2.河南省畜禽遗传资源保护与利用工程技术中心，河南郑州 450046）

淮南猪原产于淮河上游以南、大别山以北、桐柏山以东的冲积平原，主产区为新县、固始、商城、罗山和光山等地，已有一千多年的饲养历史；淮南猪具有肉质好[1]、繁殖力强[2]、杂交配合力高和适应性强[3]等优点，是河南省优良的地方猪种之一，在《中国畜禽遗传资源志•猪志》中与淮北猪、山猪、灶猪、定远猪和皖北猪5 个类群一并被列入淮猪[4]。自20 世纪80年代以来，国外瘦肉型猪种不断被引进和杂交，同时原产区饲养淮南猪的散户不断退出市场，导致纯种淮南猪饲养量逐年减少，淮南猪遗传多样性及品种保护受到威胁，已出现濒危倾向[5]。因此，了解淮南猪现有群体的遗传背景，并对其遗传多样性进行评估，对淮南猪种质资源的生态保护和科学利用具有重要的理论和实际意义。

线粒体DNA（Mitochondrion DNA，mtDNA）是细胞质内的遗传物质，具有分子结构简单、较核DNA 突变率高、进化速率快、在世代传递中几乎不发生重组和严格的母系遗传特征[6]；能直观保存群体多数中性突变的发生状态[7]。D-loop 区（Control Region Displacement loop，D-loop）为mtDNA 序列最重要的非编码区，进化速率较编码区更快[8]，是对品种内个体间及亲缘关系较近群体进行遗传分化研究的理想分子标记。目前，利用mtDNA 研究世界各地家猪和野猪遗传多样性及起源进化已有广泛报道，然而对淮南猪遗传多样性的研究较少，仅见周鑫等[9]、张晶等[10]和张家庆等[11]分别采用随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）和微卫星标记技术对淮南猪遗传背景进行了分析。本研究采集了淮南猪主产区养殖场和部分散养户的淮南猪个体耳组织样本，获取和分析mtDNA D-loop 区序列，结合GenBank 中国内外主要猪种及黄河流域古家猪D-loop 区序列信息，试图揭示现存淮南猪群体的遗传多样性和母系起源，为淮南猪种质资源的生态保护和合理利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验猪群 32 头淮南猪母猪耳组织样本分别采自淮南猪养殖场和农户散养群体，其中新县淮南猪养殖场12 头、湖北红安县农户6 头、信阳市郊区农户6 头、商城县农户8 头。每头采集耳组织0.5 g 左右，保存于75%乙醇溶液，用OMEGA 基因组DNA 提取试剂盒提取DNA。

1.2 实验方法

1.2.1 引物合成 以NCBI 上猪（Sus scrofa）mtDNA 已知序列（GenBank：AJ002189）为参考，用Primer Premier 5.0软件设计引物，用于扩增淮南猪mtDNA D-loop区，上、下游引物分别为：F：5'-ATGCAAACCAAAACGCCA GTA-3'；R：5'-TATTCAGATTGTGGGCGTATG-3'。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR 扩增及测序 20 μL PCR 扩增体系：2×PCR Mix（广州东盛生物科技有限公司）10 μL，上、下游引物（10 nmol/L）各0.8 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 7.4 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，54.5℃褪火60 s，72℃延伸75 s，30 个循环。扩增完成后，72℃再延伸5 min，4℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后委托上海生物工程有限公司纯化并双向测序，测序引物为PCR 引物。

1.2.3 统计分析 测序结果用Chromas 2.1.3 软件查看、核对，修正读取错误的碱基。得到的序列用DNAStar 7.1软件的SeqMan 进行拼接。用DnaSP 5.0 软件统计单倍型数、单倍型多样度和核苷酸多样度等。采用Arlequin 3.5 软件进行碱基不配对分析和Tajima's D 检验，以推断种群是否发生过扩张。用MEGA 5.0 分析序列的平均碱基组成、多态位点数、简约信息位点数和总体转换/颠换比例。

从GenBank 下载非洲疣猪、金华猪、通城猪、皮特兰和汉普夏等国内外主要猪种以及黄河流域家猪古代（FJ601545，FJ601530，FJ601531）mtDNA D-loop 信息，采用MEGA 5.0 和NetWork 4.6 分别构建NJ 树和网络图，分析淮南猪与国内外其他猪种的系统发生学关系。

2 结果与分析

2.1 淮南猪mtDNA D-loop 区序列及遗传多样性分析引物PCR 扩增片段与预期目的片段大小一致，条带单一（图1），去除序列两端可能测序不准确区域及引物序列，经序列比对分析，得到有效片段长度为1 170 bp（图2）。序列T、C、A 和G 4 种碱基平均含量分别为24.7%、27.1%、29.8%和18.4%，A+T 含量（54.5%）高于C+G 含量（45.5%），符合mtDNA D-loop 非编码区富含A/T 碱基的序列特征。MEGA5.0 软件在供试淮南猪群体mtDNA D-loop 区共检测到27 个多态位点，其中13 个简约信息位点，14 个单突变位点，转换/颠换平均值为2.9。DnaSP 5.0 软件分析表明，群体核苷酸多样性（Pi）为0.004 25，核苷酸平均差异数（K）为4.118；单倍型多样性（Hd）为0.968，并据此界定了20 种单倍型Hap1～Hap20（图3），其中Hap4 包含5 个个体，Hap3、Hap12 和Hap13 各包含3 个个体，Hap9 和Hap15 各包含2 个个体，其余单倍型均为1 个个体，表现为高度的遗传多样性（Hd＞0.5）。

2.2 淮南猪群体历史动态分析 采用DnaSP 5.0 软件分析淮南猪种群的历史动态，利用岐点分布和Tajima's D中性检测分析淮南猪群体是否历经群体扩张。结果显示，淮南猪群体岐点分布（Mismatch Distribution）分析图谱呈单峰分布（图4），中性检验Tajima's D 值为负值且差异显著（D=-1.445 990，P=0.027 893），表明淮南猪在形成或驯化进程中发生过明显的种群扩张。

2.3 基于mtDNA D-loop 区序列系统发育树构建与网络关系分析 本研究以非洲疣猪的mtDNA D-loop 序列为外群，利用MEGA 5.0 软件采用邻接法（NJ）构建了淮南猪与国内外83 个主要猪种的mtDNA D-loop 序列分子系统发育树（图5）。

从系统树可以看出，所分析样本明显分为2 个独立的支系：第一支以国外猪种为主，将东北野猪、杜洛克、皮特兰和汉普夏聚为一类；第二支以国内猪种为主，将淮南猪20 个单倍型与约克夏、巴克夏、长白猪和国内其他猪种聚为一类，淮南猪20 个单倍型与以大围子猪、皖南花猪、乐平花猪、上高花猪、圩猪、东乡花猪、通城猪、莱芜猪、沂蒙黑猪、河套大耳猪等为代表的华中、华北型猪种关系较近，而与华南型、西南型、高原型猪种关系较远。总体而言，淮南猪20 个单倍型在系统树上分布较为分散，母源血统遗传复杂，与华中、华北型猪种基因交流较广泛。

为进一步研究淮南猪起源进化的地域特征，本研究引入3 条黄河流域家猪mtDNA D-loop 序列古老单倍型，与淮南猪、国内外主要猪种构建Median-Joining Network 网络图（图6）。网络图所呈现的各猪种之间的关系与分子系统发育树类似，但更清晰地显示，网络图中H_4、H_5、H_6 和H_7 即淮南猪的Hap5、Hap7、Hap12、Hap16 和Hap19 为淮南猪特有单倍型，其余单倍型为品种间共享单倍型；淮南猪Hap1、Hap2、Hap3、Hap6、Hap9、Hap10、Hap11、Hap13、Hap14、Hap15、Hap17、Hap18 共12 个单倍型与华中、华北型猪种构成网络图中的主流单倍型（H1 和H2），并且与2 个黄河流域家猪古老单倍型距离关系较近。Hap4、Hap8 和Hap20 则分布于以华南型猪种为主的群体中（H3 和H8）。国外猪种皮特兰、汉普夏和杜洛克构成独立的一支（H9），而长白猪、巴克夏和约克夏与国内猪种有基因交流。

3 讨 论

3.1 淮南猪群体的遗传结构分析 遗传多样性是指生物种内遗传变异程度，是生物适应环境与进化的基础，由Hd 和Pi 值衡量[12]。本研究结果显示，淮南猪群体mtDNA D-loop 区Hd 和Pi 分 别 为0.968 和0.004 25，属高Hd（Hd＞0.5）低Pi（Pi＜0.5%）群体，据此推测淮南猪在进化过程中历经一段有效群体规模较小时期之后，可能发生了一次大而快速的群体扩张，群体扩张消除了扩张前的种群遗传结构，是导致群体单倍型多样度高而核苷酸多样度低的重要原因[13]，这与本研究中性检验结论一致；此外，淮南猪群体单倍型分布较分散也进一步说明了群体进化过程中曾经出现过群体扩张，表现为多母系起源。与淮南猪群体遗传多样性类似，我国多数地方猪种表现具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性，赵晓枫[14]用mtDNA D-loop 区研究44 个国内地方猪种遗传多样性表明，华北型、华南型、华中型、江海型和西南型猪种Hd 和Pi 值分别为0.899～0.989和0.003 4～0.004 4，总体呈现单倍型多样性丰富，核苷酸多样型匮乏的特征，相似结果在东北民猪[15]、甘南藏猪[16]、石头猪、德保猪和隆林猪[17]中均有报道；但部分猪种如陆川猪[18]、马身猪[19]、里岔黑猪、烟台黑猪和昌潍白猪[20]单倍型多样性和核苷酸多样性均相对匮乏，这可能与每个猪种形成的历史有关。因此，我国地方猪保种工作刻不容缓。

3.2 基于D-loop 区部分序列的系统进化分析 众多研究表明，采用mtDNA D-loop 序列构建国内外猪种NJ系统发育树时，中国猪种和国外猪种分别聚为独立的一支[14-15,17,19,20-23]，本研究与前人研究结果一致，进一步支持了现代家猪起源于欧亚两大母系的二元论观点，并且东北野猪没有与国内猪种聚为一类，而是与以皮特兰、汉普夏和杜洛克为代表的欧洲猪种亲缘关系较近，这可能缘于东北地域毗邻前苏联，东北野猪与欧洲野猪存在基因交流而含有欧洲野猪的血统[15]。另外，长白猪、巴克夏和约克夏与包括淮南猪在内的国内猪种聚为一类，主要原因可能是在17 世纪末及18 世纪初，英国曾经引进广东地方猪种，参与培育了巴克夏和约克夏[24]；而长白猪是由英国猪种、中国猪种和本地猪种杂交培育而成，包含有中国猪种单倍型[25]。

根据体型、外貌特征和地理分布情况，我国地方品种猪分为华北型、华南型、华中型、江海型、西南型和高原型。为探讨我国地方猪种的地域特征，本研究将淮南猪的单倍型与国内代表性地方猪种mtDNA D-loop 序列进行聚类。NJ 树显示，大围子猪、皖南花猪、东乡花猪、乐平花猪、通城猪、莱芜猪、沂蒙黑猪、武夷黑猪、河套大耳猪和嵊县花猪等华中、华北型聚为一类；糯谷猪、内江猪、莆田猪、德保猪、蓝塘猪、陆川猪、成华猪、荣昌猪、闽北花猪、滇南小耳猪、可乐猪、丫杈猪、乌金猪、槐猪、屯昌猪、巴马猪和隆林猪等华南、西南型聚为一类，某些程度上，符合我国以地理分布划分地方猪种类型的依据[21]；而玉山黑猪、赣东南花猪、八眉猪、马身猪、金华猪、梅山猪和二花脸散布在华南、西南型类群同时也说明，国内猪种聚类关系与产区地理分布并没有非常强的关联性，部分地方猪种间遗传距离与地理分布远近无必然联系，这可能与现代社会人类迁徙越来越便利、地方猪种之间基因交流频繁有关。因此，mtDNA D-loop 序列特征结合品种形成和培育的文献资料，可有效区分国内外猪种，但不能够准确为我国地方猪种分类，全基因组测序研究我国猪种的分类、起源和进化是今后研究的方向。

Network 分析显示，除5 个特有单倍型之外，淮南猪单倍型呈现广泛的地理分布，其中12 个单倍型为与华中、华北型猪种共享，表明淮南猪与华中、华北型猪种基因交流广泛；与西南、华南、江海、高原型猪种基因交流较少，但未完全阻隔。淮南猪主产于河南信阳各县区，地处淮河以南长江以北，与华中地区安徽省和湖北省接壤，是我国南北地理位置的分界区，这可能是造成淮南猪与华北、华中型基因交流广泛的原因。

研究表明，黄河中游地区的古家猪携带有现代中国家猪的母系遗传基因[26]，是中国家猪驯化中心[27]和中国家猪的独立起源地之一。而淮南猪与黄河流域古家猪亲缘关系较近，这可能是造成淮南猪单倍型广泛分布于我国现代地方猪种的主要原因；同时也可推断淮南猪虽为多母系起源群体，但主要来源于黄河流域古家猪。