特级初榨橄榄油中酚类化合物不同提取方法对比研究

李 雪，张 玉，王君虹，朱作艺，李 利，章国祥，关荣发，Ayton Jamie，李 文，王 伟，刘 军

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，杭州 310021； 2.农业农村部农产品信息溯源重点实验室，杭州 310021；3.木本油料品质营养国际联合实验室，杭州310021； 4.杭州出入境检验检疫局，杭州 310012；5.中国计量大学 生命科学学院，杭州 310018； 6.澳大利亚初级产业部 油脂研究实验室，澳大利亚 沃加沃加 2650)

橄榄油是从油橄榄鲜果中直接压榨的植物油，其含有丰富的不饱和脂肪酸、甾醇、多酚及多种微量元素，因而具有极高的营养价值及保健功能[1]，被称为“植物油皇后”和“地中海甘露”。橄榄油中含有多种极性酚类化合物，能够提高橄榄油的氧化稳定性，延长橄榄油的货架期，影响橄榄油的色泽和风味[2]。该类化合物具有抗氧化[1-3]、抗菌[4]、抗炎[4-6]、抗肿瘤[7]、降血脂[8-9]、预防阿尔茨海默病[10-13]等多种生理活性，其潜在的医药价值越来越受到研究者的关注。

橄榄油中的多酚类化合物种类繁多，但含量较低，因此有效的提取方法是对其深入研究的前提。橄榄油中酚类化合物的提取方法已有较多报道，其中应用最广泛的萃取方法分别为液液萃取法[3,14-17]和固相萃取法[18-20]。前者主要以正庚烷作为溶剂，以甲醇-水溶液作为萃取液进行目标化合物萃取，该方法重现性较好；后者主要应用二醇基固相萃取柱，以甲醇作为洗脱液进行油中多酚组分分离提取，与液液萃取法相比，其有机溶剂用量较少。液液微萃取法是近年兴起的液液萃取新技术，是将微量萃取溶剂通过微量注射器针头尖端，直接浸入样品分散液中进行萃取，该方法操作简单，耗时短，有机溶剂使用量仅在微升级[21]。目前，已有研究应用液液微萃取的方法进行橄榄油中多酚类组分的提取[22-23]。以上3种方法各有优势，但其对于橄榄油中极性酚类提取效果的比较鲜见报道。目前，已报道的橄榄油中多酚组分分析方法主要为液相色谱法[24-26]及液相色谱质谱法[14]，前者定量准确可靠且重现性好，但对于橄榄油中复杂酚类化合物的鉴别分析具有一定的局限性，后者在定量同时可获得目标化合物结构相关信息，但化合物峰分离度较差。因此，高效、快速的分析方法有待进一步开发。

本研究分别应用液液萃取法、固相萃取法及液液微萃取法对特级初榨橄榄油中极性酚类化合物进行提取，通过超高效液相色谱-高分辨质谱法(UPLC-HRMS)及Folin-Ciocalteus比色法对提取物中酚类化合物组成的研究和总酚含量的测定，比较3种方法对酚类化合物的提取效率，筛选最佳的方法，为提取方法的进一步优化提供依据，以期为橄榄油酚类化合物的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原材料为西班牙原装进口托雷多特级初榨橄榄油。没食子酸标准品(纯度>99%)，阿拉丁试剂公司；甲醇、乙醇、正庚烷、正己烷、乙酸乙酯、福林酚试剂、碳酸钠均为分析纯；乙腈为色谱纯，德国默克公司；超纯水，Millipore纯水仪制备。二醇基固相萃取柱(500 mg，3 mL)，济南博纳生物技术有限公司。

Waters Acquity UPLC液相色谱串联Waters Synapt G2S四级杆飞行时间高分辨质谱仪，美国Waters公司；RV10-D-V型旋转蒸发器，艾卡(广州)仪器设备有限公司；722型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同方法提取特级初榨橄榄油酚类化合物

1.2.1.1 液液萃取法

准确称取油样10.00 g，加入20 mL正庚烷，振摇，使油样完全溶解，加入20 mL甲醇-水溶液(体积比60∶40)，在50 mL分液漏斗中振摇2 min，静置分层，收集下层清液；上层液体加入20 mL甲醇-水溶液(体积比60∶40)重复操作，静置分层，收集下层清液，合并两次清液后加入20 mL正庚烷进行洗涤，得到澄清下层液体。将下层液体进行低温减压旋蒸除溶剂后，密封，于-20℃避光保存，备用。

1.2.1.2 固相萃取法

准确称取油样1.25 g，溶于3 mL正己烷中。分别用3 mL甲醇和3 mL正己烷平衡固相萃取柱，真空抽滤；上样，用3 mL正己烷淋洗萃取柱，重复1次，再用3 mL正己烷-乙酸乙酯(体积比90∶10)淋洗萃取柱，弃去全部淋洗液；最后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，于低温条件下旋转蒸发仪蒸干溶剂，-20℃避光保存，备用。

1.2.1.3 液液微萃取法

参照文献[23]方法，准确称取2.00 g油样于带塞试管中，配制1 mL正庚烷与150 μL乙醇-水溶液(体积比60∶40)混合液，用2 mL注射器将混合液快速注入油样中，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，用微量注射器吸取下层液体，氮气吹干，-20℃避光保存，备用。

1.2.2 提取物中酚类化合物组成的超高效液相色谱质谱分析

不同方法获得的提取物分别用500 μL甲醇-水溶液(体积比1∶1)复溶，涡旋振荡1 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，用于液质分析。

超高效液相色谱条件：Waters Acquity UPLC RP18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温35℃；样品室温度10℃；流动相A为0.1%甲酸-水，B为乙腈；洗脱梯度为0～10 min 95.0%～75.0% A,10～25 min 75.0%～70.0% A,25～50 min 70.0%～0.0% A,50～51 min 0.0%～95.0% A,51～60 min 95.0%～95.0% A；流速0.3 mL/min。

质谱条件：ESI电喷雾离子源(美国Waters)；负离子模式；毛细管电压2.5 kV；锥孔电压35 V；离子源温度120℃；脱溶剂气温度350℃；锥孔气流量50 L/h；脱溶剂气流量600 L/h；质谱采集范围(m/z)100～1 000。校正曲线：甲酸钠，分辨率模式。实时校正：2 ng/mL亮氨酸脑啡肽，15 s校正1次，每次0.5 s，5 μL/min。

1.2.3 总酚含量的测定

参考LS/T 6119—2017采用Folin-Ciocalteus比色法于750 nm波长处测定提取物的吸光度，并根据没食子酸标准工作曲线计算样品中的总酚含量。

1.2.4 数据分析

本研究获得的数据采用3次重复实验的平均值和相对标准偏差(RSD)表示。利用GraphPad Prism5软件进行数据统计分析，P<0.05被认为是显著，P<0.01被认为是极显著。

2 结果与讨论

2.1 特级初榨橄榄油中酚类化合物组成的液相色谱质谱分析

橄榄油中酚类化合物种类繁多，结构复杂，因此应用色谱技术对其分离分析具有一定的挑战性。UPLC-HRMS针对含有复杂组分的样品具有分离速度快、灵敏度高、可同时获得目标化合物结构相关信息等优点。因此，UPLC-HRMS可成为橄榄油酚类化合物分离分析的强有力工具。本研究首先对多酚组分的仪器条件进行了优化。对于液相色谱条件，首先对流动相进行了考察，分别以纯水、0.1%甲酸-水及0.2%甲酸-水作为水相，对比分离结果，由于多酚类组分呈弱酸性，在酸性流动相中获得更好的峰形，而两种酸性水相差别不大，因此选择0.1%甲酸-水作为水相；本研究还对比了Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)及Waters Acquity UPLC RP18两种色谱柱的分离效果，前者所需时间长，且分离度较低，因此选择RP18柱用于色谱分离。对于质谱条件，主要考察了待测成分在正负谱中的信号响应，结果显示，负离子模式能提供更多的化合物种类信息，因此采用负离子模式进行分析；其他质谱参数通过仪器自动优化获得。优化后的液相色谱质谱条件见1.2.2。

应用优化的条件对提取物进行检测。得到的总离子流图见图1。由图1可以看出，该分析方法的色谱峰分离度较好。通过文献[14,17,27]对照及高分辨质谱信息对化合物的结构进行推断，结果见表1。

由表1可知，3种方法从特级初榨橄榄油中共检测到40种酚类成分，按照结构的不同可以分为酚酸类、酚醇类、裂环烯醚萜类、黄酮类及其他等5类化合物，其中酚醇类和裂环烯醚萜类为主要成分，酚醇类主要为羟基酪醇，裂环烯醚萜类主要为橄榄苦苷元、女贞苷元。液液萃取法提取的酚类化合物种类明显多于液液微萃取法和固相萃取法。液液萃取样品中共检测到33种酚类化合物，包括酚酸类、酚醇类、裂环烯醚萜类、黄酮类等；固相萃取样品中共检测到20种酚类化合物，包括酚醇类、裂环烯醚萜类、黄酮类等；液液微萃取样品中共检测到15种酚类化合物。以上结果表明，不同萃取方法导致橄榄油样品的酚类化合物在其组成上出现较大差别。其中，液液萃取法对于含量较低的酚酸类(咖啡酸)及多种橄榄苦苷和女贞苷的衍生物具有较好的提取效率；固相萃取法对女贞苷元和羟基酪醇的提取效率较高；而液液微萃取法仅对橄榄苦苷元和羟基酪醇具有较好的提取效果，对其他成分提取效率较低。

表1 特级初榨橄榄油中酚类化合物组成

注：a.液液萃取法；b.固相萃取法；c.液液微萃取法；“+”检出，“-”未检出。

图1 不同方法提取特级初榨橄榄油中酚类化合物UPLC-HRMS总离子流图

2.2 不同方法提取特级初榨橄榄油总酚含量比较

本研究采用Folin-Ciocalteus比色法对3种方法提取的样品进行总酚含量测定。以吸光度(x)为横坐标，没食子酸标准溶液的质量浓度(y)为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为：y=96.82x+0.838 7(R2=0.999 8)，结果表明其线性关系良好。依据此回归方程计算3组样品中总酚含量，结果见表2。

表2 不同方法提取特级初榨橄榄油中总酚的含量(n=3)

由表2可见，不同方法提取的橄榄油总酚含量差异明显，3种方法提取总酚的含量高低顺序为液液萃取法>固相萃取法>液液微萃取法。液液萃取法提取的总酚含量明显高于其他两种方法，液液微萃取法提取的总酚含最最低。统计分析表明，3种方法提取结果比较均具有极显著差异(P<0.01)。

2.3 不同提取方法实验过程比较

本研究对3种提取方法实验过程中所需的材料及时间等进行比较，结果见表3。

表3 不同提取方法实验过程比较结果

由表3可见：液液萃取法所需的油量是固相萃取法的8倍，液液微萃取法的5倍；使用有机溶剂体积分别是固相萃取法和液液微萃取法的3.2倍和58.7倍；所需实验时间是固相萃取法的3.7倍，液液微萃取法的11.2倍。结果表明，液液萃取法相对于另外两种方法耗费油量最多，费时费力，且需有机溶剂最多，而液液微萃取法操作简单，耗时短，所需有机溶剂量远低于液液萃取法及固相萃取法。

3 结 论

本研究应用液液萃取法、固相萃取法和液液微萃取法提取特级初榨橄榄油中酚类化合物，通过对提取样品中酚类化合物的组成分析和总酚含量测定对比研究3种方法的提取效率。结果表明：液液萃取法提取的酚类化合物种类明显多于其他两种方法，同时总酚含量也最高，与其他两种方法相比具有极显著差异。通过实验过程比较，液液萃取法存在耗油量多、步骤烦琐、耗时长、需消耗大量的有机试剂等不足。而液液微萃取法具有溶剂用量少、耗时短、操作简单的优点，符合绿色环保样品前处理的发展方向，可对其进一步优化，以期达到多种类酚类化合物的高效、快速、无污染提取。