TIM-3及STAT3基因在结直肠腺癌中的研究进展

李福青 王 红 蒋海涛 杜胜奇 钟江利

(遵义医科大学附属医院消化内科，遵义 563003)

1 TIM-3与结直肠腺癌

1.1TIM-3基因概述 T细胞免疫球蛋白黏蛋白(T-cell immunoglobulin mucin)基因家族在鼠类中包括TIM1～TIM8，但仅有3种位于人染色体5q33.2，即TIM1、TIM3及TIM4[1]。TIM基因家族编码的膜蛋白Ⅰ即为TIM-3，由黏蛋白样区、免疫球蛋白样区、跨膜区和胞内区组成。TIM-3首次出现于Th1细胞表面，也表达于多种免疫细胞，如CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、肥大细胞及巨噬细胞等[2，3]。细胞免疫激活需要2个信号，第2个激活信号需要抗原刺激T细胞表面上共刺激分子及呈递细胞(APC)细胞表面上的共刺激物相互作用，程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)和TIM-3是T细胞表面共刺激因子家族中最重要的负调节信号，导致CD8+T细胞无法分泌TNF-α、IFN-γ及IL-2，减弱、限制或终止T细胞免疫应答[4-8]。肿瘤细胞的基本生物学特性为细胞增殖和迁移，TIM-3持续高表达可通过抑制细胞免疫反应抑制肿瘤细胞免疫应答，促进肿瘤细胞增殖和迁移。膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma、BUC)患者中，杨猛等[9]通过免疫组化法SP法研究得出TIM-3表达水平与BUC预后、临床分期、病理分级等密切相关，因此肿瘤细胞持续高表达TIM-3与肿瘤生长、复发及转移密切相关。

1.2TIM-3与结直肠腺癌 全球范围内结直肠腺癌发病率及患病率呈逐年上升趋势，且患者趋于年轻化，威胁人类生命健康。我国结直肠腺癌的患病率位居第三，在男性恶性肿瘤中仅次于肺癌、胃癌、肝癌位居第四，而在女性恶性肿瘤中位居第三。随饮食结构、生活方式的不同，农村及城市结直肠腺癌发病率也不一致，在城市地区恶性肿瘤中，结直肠腺癌发病率仅次于肺癌位居第二，在农村地区结直肠腺癌发病率仅次于胃癌、肺癌、食管癌、肝癌位居第五[10,11]。研究表明，TIM-3可表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、肝癌、肾透明细胞癌、胃癌、结直肠腺癌及甲状腺癌细胞等[12-16]。

在肿瘤微环境中，持续高表达TIM-3分子的糖基化侧链及其配体半乳凝素9(galectin-9)结合后，一方面可促进髓源抑制细胞(CD11b+Gr-1+MDSC和CD4+FoXP3+Treg)增殖，抑制CD8+T细胞，促进肿瘤生长，另一方面特异性降低转录因子在T细胞中的表达，即TIM-3和BAT-3结合后导致细胞内片段分离，并将抑制信号传递至细胞内片段，削弱T细胞增殖，加速其衰竭并导致凋亡，抑制T细胞介导的免疫应答[17-21]。结肠癌中TIM-3分子远端的N-黏性末端可通过与癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen associated cell adhesion molecule 1,CEACAM1)顺式或反式结合，导致TIM-3与Bat3结合，从而上调TIM-3表达，削弱T细胞免疫反应，促进肿瘤细胞增殖[22]。Huang等[23]通过小鼠直肠癌模型实验证实CEAAM1 TIM-3细胞比例远高于CD4细胞，同时，CEACAM1可通过调节TIMP-3表达诱导T细胞免疫耐受，削弱结直肠腺癌患者免疫系统的抗肿瘤能力。肿瘤患者免疫系统中固有免疫是第一道防线，Chiba等[24]研究发现，结直肠腺癌患者的浸润性DC TIM-3持续高表达，与核酸竞争与高迁移率蛋白B1(high mobility protein B1，HMGB1)结构域A盒竞争，阻碍核酸与HMGB1结合，因此抗原抗体复合物无法通过Toll样受体(toll-like receptors、TLR)被识别，导致白细胞介素受体相关激酶，被阻断，从而破坏HMGB1介导核酸发挥细胞固有免疫，导致肿瘤细胞凋亡后由核酸释放的免疫原性降低，抑制核酸介导的先天性抗肿瘤免疫反应。持续高表达TIM-3还可通过促进巨噬细胞M2型极化、抑制M1型极化减弱巨噬细胞吞噬和杀伤效应抑制结直肠腺癌患者肿瘤细胞免疫应答，导致结直肠腺细胞免疫逃逸，促进结直肠腺癌肿瘤细胞不断增殖分化[25]。Wang等[26]研究发现，阻断TIM-3可提高机体固有免疫，一定程度增强机体抗肿瘤能力。细胞免疫中，TIM-3持续表达与Gal-9结合后导致钙离子内流至Th1细胞胞内区，降低Th1细胞中IL-12亚单位P40和P36的转录抑制分化，同时限制IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌，直接或间接削弱CD8+T细胞、NK细胞毒性[27,28]。

1.3TIM-3与结直肠腺癌免疫治疗 TIM-3主要通过抑制T细胞免疫应答促进肿瘤细胞增殖，其作为肿瘤治疗靶点的作用机制如下：①抑制IL-6、IL-27等炎症因子释放，利用TIM-3中和抗体处理肝癌HepG2和SMMC7721细胞，阻断TIM-3信号通路后，以IL-6(100 ng/ml)刺激肝癌细胞系，中和抗体处理过后的IL-6分泌明显减少，促进肝癌细胞增殖的作用明显减弱；②使用疫苗和嵌合抗原受体T细胞激活免疫细胞；③TIM-3单克隆抗体直接作用或联合其他检查点的单抗发挥作用；④抑制TIM-3受体与其配体结合，将抗TIM-3抗体或抗Gal-9抗体应用于鼻咽癌细胞，鼻咽癌细胞增殖受到抑制，解除鼻咽癌外核体对Th1细胞的免疫抑制，进而恢复T细胞的抗肿瘤效应[29]。

2 STAT3基因与结直肠腺癌

2.1STAT3基因概述 STAT是由细胞因子和生长因子等肽类配体激活的细胞质转录因子，具有双重功能，在细胞核的启动子中传递细胞质信号和调控基因转录，在调节正常细胞的分化、增殖和凋亡中起重要作用。STAT3共包括7种蛋白，分别为STAT1～STAT4、STAT5a、STAT5b及STAT6[30]。STAT3是STAT家族成员，是细胞内重要的信号传递分子，接收信号并将其他信号传递至细胞核，调控下游基因转录。STAT3蛋白分子量约为89～92 kD，由750～795个氨基酸残基组成，包括螺旋区、N 端氨基酸保守序列、SH2结构域、DNA结合域连接区和C端转录活化区6个功能结构域。STAT3主要由细胞因子(IL-6)和生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体促进相邻JAKs聚集、JAK-STAT信号通路磷酸化和激活，酪氨酸残基在SH2结构域和受体中的磷酸化导致STAT3活化。STAT3与相应的受体分离形成二聚体，从细胞质转运至细胞核，成为转录基因[31]。

2.2STAT3与结直肠腺癌 STAT3在细胞增殖及分化中起重要作用，是信号转导及转录的关键激活蛋白。STAT3对肿瘤细胞增殖、分化和新生血管形成具有促进作用，是公认的促癌基因，在肿瘤信号转导通路中起重要作用。STAT3在白血病、前列腺癌、多发性骨髓瘤、结直肠腺癌、乳腺癌及肝癌等实体肿瘤及血液组织中持续高表达，参与肿瘤的抗凋亡、增殖、分化、转移、血管形成等过程。肿瘤细胞中，STAT3通过SH2结构域与受体中磷酸化的酪氨酸残基作用，不断激活STAT3，同时c-Jun氨基末端激酶可直接磷酸化STAT3的727位丝氨酸位点，激活STAT3[32]。将肺癌小鼠的STAT3基因敲除后，发现 STAT3 敲除的肿瘤细胞不仅大量分泌炎症趋化因子，且MHC-Ⅰ抗原表达降低，NK细胞敏感性增强[33]。张国强等[34]通过免疫组化实验证明持续高表达的STAT3基因参与结直肠腺癌发生发展，且与结直肠腺癌患者TNM分期及淋巴结转移密切相关，STAT3的连续激活调节多种基因表达，包括负性免疫应答因子(如IL-10、VEGF、TGF-β)和细胞增殖、凋亡和循环相关基因(Bcl-xL、CycCd1、Mcl-1、Survvin、cyclin等)。结直肠腺癌中，通过结合BH1、BH2和Bax持续激活STAT3，全国Bcl-xL和Bcl-2，形成2种同源聚合物和2种非均相聚合物，导致细胞增殖和凋亡失衡，促使STAT3不断被激活[35]。c-myc基因和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)通过SH2结构域和Src表达上调，抑制结直肠腺癌细胞凋亡并促进其增殖，导致结直肠腺癌发生发展[36-40]。持续活化的STAT3在肿瘤细胞微环境中导致IL-12/IL-23失衡，IL-12分泌减少，同时IL-23通过调节T细胞提高肿瘤免疫抑制分子活性。研究表明，IL-6是STAT3的重要细胞活化因子[41]。IL-6与配体GP130结合激活JAK激酶，磷酸化STAT3，激活JAK2/STAT3信号通路，并在JAK激酶作用下促进结直肠腺癌细胞增殖。张晓芹等[42]通过免疫组化表明，结直肠腺癌细胞中STAT3表达与IL-6表达上调，且呈正相关，提示IL-6可能作为细胞活化因子诱导STAT3活化，促进信号转导，参与结直肠腺癌发生发展。同时JAK2/STAT3信号通路也可通过VEGF促进肿瘤新生血管生成，导致结直肠腺癌细胞转移。此外STAT3不仅可直接调控VEGF，同时持续活化的STAT3也可通过表达HIF-1α间接促进VEGF生成，促进结直肠腺癌细胞增殖[43-46]。

2.3STAT3与肿瘤治疗 STAT3是肿瘤中多种信号通路的连接点，阻断STAT3可阻断肿瘤多种信号通路，抑制肿瘤细胞增殖。目前阻断STAT3的方法有：①寡核苷酸、反义寡核苷酸主要通过将STAT3与STAT3 mRNA结合，诱骗寡核苷酸结合活性STAT3以减少STAT3和特异性反应原基结合，阻断STAT3信号通路的转导，在肺癌A549细胞中，利用反义寡核苷酸转染后，其增殖抑制率和细胞凋亡明显上升[47，48]；②RNA干扰法，利用RNA干扰法沉默结直肠癌细胞系HT29 、SW1116细胞中的STAT3基因72 h后发现，肿瘤细胞凋亡率上升[49]；③抑制JAK激酶激活，细胞因子信号抑制剂(SOCS)通过结合或抑制JAK抑制STAT3磷酸化，活化的STAT蛋白抑制剂(PIAS-3)可与2种STAT3聚合物结合防止STAT3与DNA结合并诱导其连续激活，AG490可抑制JAK激酶活化，目前已广泛应用于肿瘤治疗[50]；④显性负性技术，野生型显性负蛋白可降低STAT3和特异性反应的原始结合阻断STAT3信号通路，突变显性负蛋白主要通过阻断STAT3和DNA结合，下调抗凋亡基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长；⑤干扰素诱导死亡相关基因19，结合STAT3抑制STAT3核转位，抑制IL-6诱导的STAT3相关靶基因表达，抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。

3 TIM-3和STAT3 在肿瘤中的相关性

TIM-3和STAT3在肿瘤中的作用一直是国内外研究重点。TIM-3可在肿瘤中调节STAT3信号通路而发挥作用，激活巨噬细胞和内皮细胞NF-κB通路，参与肿瘤发生发展。NF-κB信号通路的激活可提高IL-6表达，促进STAT3激活，从而促进肿瘤细胞增殖与迁移[51，52]。IL-6作为炎症因子，主要诱导T、B细胞分化及促进造血功能等，但IL-6亦可抑制免疫系统，刺激肿瘤细胞新生血管形成，参与肿瘤发生发展。IL-6可表达于结直肠腺癌细胞，持续高表达的IL-6诱导Th17表达，促发炎症反应进而诱导结直肠腺癌发生，IL-6促进肿瘤发生发展的方式主要为激活STAT3表达，通过经典途径即IL-6R直接与配体gp130特异性结合和跨信号转导途径即IL-6不通过IL-6R与gp130特异性结合，直接与sIL-6R结合形成sIL-6R/IL-6复合物，刺激细胞膜上gp130形成同源二聚体，激活JAK激酶同时磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信号通路激活，表达和转录靶基因，促进结直肠腺癌细胞增长及新生血管形成，减少腺癌细胞凋亡。IL-6促进肝癌细胞增殖依赖于TIM-3，STAT3作为IL-6的下游基因，持续高表达的TIM-3可使肝癌细胞株STAT3显著激活，抑制STAT3可显著抑制TIM-3表达，并下调IL-6表达，因此TIM-3可能通过活化STAT3参与IL-6/STAT3信号促进肝癌细胞增长。目前国内外关于TIM-3激活IL-6/STAT3信号通路促进结直肠腺癌细胞增殖的研究较少，TIM-3作为IL-6的上游信号，是否可通过调控上游TIM-3抑制IL-6/STAT3信号通路在结直肠腺癌中发挥作用需进一步研究。

4 展望

综上所述，STAT3及TIM-3基因对肿瘤的影响是近年研究热点，STAT3及TIM-3基因在结直肠腺癌的发生发展中起重要作用。TIM-3可通过激活IL-6/STAT3信号通路抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，但目前关于TIM-3激活IL-6/STAT3信号通路促进肿瘤细胞增殖的研究较少，是否可通过调控上游TIM-3基因抑制IL-6/STAT3信号通路在肿瘤中的作用将成为结直肠腺癌新的研究方向。