体内荧光活体成像观察miR-581对结直肠癌细胞SW620转移能力的影响①

丁婷婷 张 红 冯继红 马 虎

(遵义医科大学附属医院肿瘤医院肿瘤科，遵义 563003)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤。主要发生于直肠和乙状结肠交界处，在40～50岁人群发病风险最高，男性的发病率是女性的2～3倍[1]。CRC具有侵袭性和转移性，伴有疗效差、复发率高、预后差及高发病率等特点，其发病率和死亡率分别排在所有恶性肿瘤的第三和第四[2，3]。随着经济的发展和人们生活方式的变化，CRC的发病率升高，且发病人群年轻化[4]。2017年Siegel等[5]发现，尽管年轻群体中CRC患者仅占癌症患者总数的一小部分，但在该群体中CRC的发生率正在以惊人的速度上升。其隐匿的临床表现和预后不良的特点，已经对人类健康造成重大负担。

miR-581是一类新近发现的大小约85 bp的miRNA分子[6]。课题组前期研究发现miR-581在CRC组织中低表达，且在细胞水平检测出其可抑制CRC细胞的侵袭和迁移并验证miR-581靶向调控PRDX1[7]。本研究通过上调CRC细胞株SW620中miR-581表达，利用带有荧光素酶标记的病毒感染CRC细胞株SW620(记为miR-581-NC-Luc、miR-581-UP-Luc)，经尾静脉注射入裸鼠体内，建立裸鼠CRC转移模型，通过体内荧光成像动态观察miR-581对CRC生长及转移能力的影响。体外细胞水平验证结合体内组织水平验证综合评估miR-581在体内外对CRC细胞株生物学行为的影响，为深入研究抑制CRC肿瘤细胞转移的相关机制并找到抑制手段提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与细胞 4周龄左右的雌性BALB/c SPF级裸小鼠，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号码：SCXK(湘)2014-0011；SW620细胞株购自上海生命科学研究院细胞库。

1.1.2试剂和仪器 L-15 培养基购自美国 Gibco 公司；荧光素酶慢病毒诱导表达载体购自上海吉凯基因；Lumina LT小动物活体成像系统购自美国Perkin Elmer公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 结直肠癌细胞株 SW620培养于含10%FBS和1%PEST。L-15培养基，培养条件为 37℃、5%CO2，每 2～3 d 换液1次，当细胞数达长满培养瓶底部时，收集细胞。

1.2.2制备miR-581-NC和miR-581-UP稳转株 荧光素酶标记的慢病毒感染处于对数生长期的SW620细胞，胰酶消化，完全培养基制成5×104个/ml细胞悬液，并以2.5×106个/孔细胞接种于6孔板、继续培养保证感染时铺板量达到15～30%。根据预实验结果，12 h更换感染培养基，根据病毒MOI值加入1 μl病毒感染。观察感染后细胞状态及感染效率。若下游为细胞功能实验，需保证感染效率达到 80%左右；若为筛靶实验，则感染效率需达到 90%以上。

1.2.3尾静脉注射转移模型的构建 准备好肿瘤细胞后(2×107/ml)，一次性无菌注射器吸取细胞，缓慢注射至裸鼠尾静脉，100 μl/只。活体成像仪下观察细胞接种情况：10 μl/g剂量腹腔注射D-Luciferin(15 mg/ml)，15 min后，按10 μl/g剂量腹腔注射 0.7%戊巴比妥钠麻醉动物，待动物麻醉，将其置于活体成像仪下成像，观察荧光，保存数据。实验组及对照组各5只裸小鼠，两组裸小鼠从尾静脉注射后第一周开始活体成像动态观察，之后每周观察1次。连续观察5周结束实验，结束前对小鼠进行最后1次活体成像，方法同上。

1.2.4取转移肺组织做HE染色及组织免疫荧光 成像结束后，对实验动物注射过量 2%戊巴比妥钠(0.5 ml)安乐致死，待其完全昏迷再进行颈椎脱臼确认死亡。取出其肺、肝脏及其他器官组织，荧光成像观察其器官组织是否有出现转移灶，并进行荧光定量分析。将取出的肝、肺等器官，置于多聚甲醛固定常温或-80℃冷冻后液氮保存，为后续HE染色及免疫荧光等实验作准备。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0统计软件分析数据，行方差齐性分析检验，F≥0.05，则按等方差双样本检验得到P值，F<0.05，则按异方差双样本检验得到P值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1miR-581-Luc转染SW620细胞后转染效率检测 两组均成功转入病毒，PRDX1的荧光表达强表明SW620-miR-581-UP组的表达强度较SW620-NC组减弱。见图1。

2.2miR-581对SW620中PRDX1在mRNA水平表达的影响 qRT-PCR结果显示，SW620-miR-581-UP组PRDX1表达水平显著低于SW620-NC组(P<0.05，图2)。

2.3尾静脉注射转移模型的建立 结果表明，两组细胞接种后第2周即可通过活体成像系统在胸部检测到肿瘤细胞的发光信号，荧光信号随接种时间增长逐渐增强，在第5周达到最强(图3)。区域内荧光表达总量可以间接反映携带荧光标记的细胞数量或肿瘤体积。

2.4转移结果统计 转移结果统计为：SW620-NC组尾静脉接种5只，肺转移4只，转移率80%；SW620-miR-581-UP组尾静脉接种5只，肺转移3只，转移率60%。SW620-NC组及miR-581-UP组裸小鼠均未发现肝转移灶。分析各组裸鼠的区域内荧光表达量，结果表明，实验组各裸鼠平均荧光表达量较NC组低(P<0.05)，测定值差异为20%～50%，判断为阳性结果，见图4。

2.5转移裸小鼠肺组织的HE染色 镜下可见肿瘤细胞排列成巢状或团索状，肿瘤细胞大小各异，形态不规则，胞浆丰富，细胞核大而深染，核分裂象多见(图5)。

图1 细胞荧光间接检测SW620细胞转染后miR-581的表达Fig.1 Indirect detection of expression of miR-581 after transfection of SW620 cells by cell fluorescence

图2 qRT-PCR检测SW620细胞转染后PRDX1表达Fig.2 qRT-PCR detection of PRDX1 expression after SW620 cell transfectionNote:Compared with SW620-miR-581-UP，***.P<0.05.

图3 活体荧光成像动态监测原位移植SW620-Luc细胞在裸鼠体内表达情况Fig.3 Dynamic monitoring of in vivo fluorescence imaging of SW620-Luc cells in nude mice

图4 实验组及对照组裸鼠转移情况统计Fig.4 Statistics of metastasis of nude mice in experimen-tal group and control groupNote:A.Fluorescence expression in lung area of nude mice；B.Comparative analysis of fluorescence expression in average area of experimental group and control group.

图5 光镜下观察裸鼠肺组织CRC转移灶Fig.5 Observation of metastasis of CRC in lung tissues of nude mice under light microscope

图6 转移裸小鼠肺组织标本免疫荧光检测PRDX1的阳性率Fig.6 Immunofluorescence detection of PRDX1 positive rate in lung tissue of transferred nude mice

2.6转移小裸鼠冰冻肺组织切片免疫荧光染色 SW620-NC对照组PRDX1表达量高于SW620-miR-581-UP实验组，从组织水平证明miR-581上调可降低PRDX1表达，与细胞水平的实验结果一致(图6)。

3 讨论

活体成像技术已被用于多种肿瘤动物模型中原发性肿瘤生长及转移情况的检测[8]。该技术可随时间推移对同一组动物中的肿瘤负荷进行非侵入性动态观察和实时评估[9]。荧光素酶基因可以稳定地整合至靶细胞染色体，且不会随细胞分裂而丢失。荧光素酶转染的细胞几乎可以监测动物体内的任何位置，仅有少数细胞足以产生可通过MRI或CT扫描检测不到的信号[10-12]。此外，荧光活体成像可定量标记体内肿瘤细胞的存活数量，从而在同一实验或多个实验中进行比较。非侵入性地跟踪体内肿瘤细胞并实时观察其生长可以更好地理解癌症发展机制及干预手段的疗效[13]。活体成像技术在肿瘤干预的实时观察研究中具有重大意义[14]。

miRNAs在肿瘤中多为异常表达，近年研究提示miRNA在肿瘤的发生发展中起关键作用，其可靶向作用于多种基因参与肿瘤细胞的生物学过程[15,16]。过氧化还原酶1(PRDX1)又称为增殖相关蛋白，属于过氧化还原酶超家族主要成员，定位于细胞质，与细胞的增殖和分化相关，在乳腺癌、肺癌及CRC等多种实体瘤组织中高表达[17]。课题组前期生物信息学分析发现PRDX1的3′UTR区有miR-581结合位点，并在细胞水平上验证得出miR-581靶向负调控PRDX1。但肿瘤的发生发展机制复杂，且miRNA调控的基因数目众多，可调控很多靶点，在不同的肿瘤中可能发挥不同的作用[18-20]。

本研究利用慢病毒包被含有荧光素酶基因的质粒，通过慢病毒的感染将荧光素酶基因转染至CRC SW620细胞，并设置分组为miR-581-NC组和miR-581-UP组。通过免疫荧光检测PRDX1表达间接检测miR-581的表达，结果发现相较于对照组，miR-581上调组PRDX1荧光表达相对较弱，表明miR-581表达上调，病毒转染成功，经筛选获得能够稳定表达荧光素酶的细胞株，建立裸鼠CRC皮下异位移植瘤模型。6周后统计得出结果为：相较于miR-581-NC组，miR-581-UP组的裸鼠体质量无变化(P>0.05)；miR-581-NC组尾静脉接种5只，肺转移4只，转移率80%；miR-581-UP组尾静脉接种5只，肺转移3只，转移率60%。通过总转移率、转移灶个数、转移区域内荧光表达量等多方面分析初步得出，相对于miR-581-NC对照组，miR-581-UP实验组SW620在体内转移能力有所下降；HE染色可以清晰看到核大深染的癌巢细胞团。结合课题组前期体外试验结果得出，miR-581促进CRC细胞增殖，抑制其侵袭和转移，与体内试验结果趋势一致，即miR-581过表达抑制CRC的体内外的转移能力。

综上所述，从动物水平出发利用荧光活体成像阐述miR-581在CRC转移中发挥的重要功能。该技术在结直肠动物模型的活体成像过程中具有直观性、连续性及敏感性等特点，与组织离体镜下观察相结合，提高了检测的准确性及实用性，对今后CRC的早期诊断、早期治疗及抗癌药物疗效评估有重要意义。