NLRP3炎症小体在MS/EAE发病机制中的作用及其靶向治疗*

杨一凡，刘立丽，聂作明，吕正兵，王 丹

(浙江理工大学 1浙江省家蚕生物反应器与生物医药重点实验室， 2生命科学与医药学院， 浙江 杭州 310018)

多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是由免疫细胞攻击中枢神经系统(central nervous system，CNS)而造成的一种自身免疫性疾病，其具有神经元脱髓鞘、神经胶质细胞增生和轴突损伤等病理特征[1]。NLRP3炎症小体作为一种能识别病原体和危险信号的传感器，近年来被发现与许多自身免疫性疾病的发病关系密切[2]。本文从NLRP3炎症小体激活的主要途径出发，综述了NLRP3炎症小体在MS及其动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)发病中的作用以及靶向治疗研究进展。

1 炎症小体

1.1炎症小体的结构 炎症小体是一种多蛋白复合体，典型的炎症小体由模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)参与组装，能够识别胞质中的病原微生物以及危险信号[3]。目前，已经发现了5种主要PRR信号转导型受体家族，分别是位于细胞膜上的Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)、位于胞内的维甲酸诱导基因Ⅰ样受体[retinoic acid-inducible gene Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors，RLRs]、核苷酸结合寡聚化结构域样受体[nucleotide-binding oligomerization domain(NOD)-like receptors，NLRs]和DNA识别受体[4]，其中NLR家族的特点是中央为核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain， NACHT)，C-端通常为富含亮氨酸重复序列(leucine-rich repeats，LRRs)，N-端为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶募集结构域(caspase recruitment domain，CARD)和热蛋白结构域(pyrin domains，PYD)[2]，见图1。在NLR炎症小体复合体家族中，NLRP3炎症小体的研究最为广泛，它是控制白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18成熟的关键信号分子。

Figure 1. The schematic diagram of NLRP3 inflammasome. The NLRP3 inflammasome is comprised of three proteins: NLRP3 scaffold, adapter protein ASC, and procaspase-1. The NLRP3 is characterized by the presence of a central NACHT domain, which is commonly flanked by C-terminal LRRs and N-terminal CARD or PYD domains.
图1 NLRP3炎症小体结构示意图

1.2NLRP3炎症小体的激活信号 典型的NLRP3炎症小体激活分为2步(图2)，且在转录和翻译后水平都受到严格调控。信号1为激活的启动信号，由TLRs、NOD2、TNFR1或TNFR2激活NF-κB信号通路，而后上调NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的表达[5]。信号2为活化信号，当细胞受到由危险信号相关分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMP)或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的信号刺激时，就会触发NLRP3的自体寡聚化，并与接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)进行组装，招募pro-caspase-1进而促发炎症级联反应[2]。最近的研究发现高尔基体反面网络结构(trans-Golgi network，TGN)通过其膜上富集的带负电磷脂酰肌醇四磷酸募集处于胞质中的NLRP3，在其分散结构dTGN上组装成NLRP3炎症小体[6]。同时，活化的caspase-1可作用于消皮素D(gasdermin D，GSDMD)，释放其活化的N端，介导细胞焦亡[7]。

能激活NLRP3炎症小体的PAMP信号有很多(图2)，真菌、细菌、病毒和寄生虫均有此功能，如肺炎支原体[8]、白色念珠菌[9]、霍乱弧菌[10]、丙型肝炎病毒[11]及曼氏血吸虫[12]等都能激活NLRP3炎症小体。识别DAMP信号同样是NLRP3炎症小体的重要生理作用，如胞外ATP就是一种广泛存在的DAMP信号[13]。其它如尿酸盐结晶[14]、β淀粉样蛋白[15]，外源环境中的二氧化硅和铝盐[16]等也属于能够激活NLRP3炎症小体的DAMP信号。

1.3NLRP3炎症小体的激活机制 目前，普遍认为NLRP3炎症小体的激活机制主要有以下3种：

1.3.1胞内K+浓度的降低 K+的外流是NLRP3炎症小体激活的特定上游条件，而Na+的流入则是非必需的[17]。当细胞受到细菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激后，膜上的ATP通道Pannexin-1裂解，随后ATP释放，胞外ATP进而激活P2X7受体(P2X7 receptor, P2X7R)，同时胞外ADP激活P2Y1受体，导致胞内K+浓度下降，同时，胞外K+浓度的升高以及ATP和P2X7R的结合反过来也会进一步刺激Pannexin-1通道开放[13]。

1.3.2线粒体释放线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)、心磷脂和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 线粒体受到PAMP和DAMP信号的刺激后，会释放mtDNA、心磷脂和ROS[18]。mtDNA是一个有着大量CpG岛的环形DNA，能被CpG DNA受体TLR9所感知，从而激活NF-κB信号通路，引起NLRP3炎症小体激活[19]。在TRPM2通道介导的Ca2+内流过程中，也会产生过量的ROS[20]。ROS是ATP刺激或颗粒物吞噬作用触发NLRP3炎症小体激活的关键，Li等[21]的研究发现ROS诱导的内质网应激反应通过诱导硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)而激活NLRP3炎症小体。而且不同来源的ROS会以不同方式调节炎症小体的激活。

Figure 2. Mechanisms of NLRP3 inflammasome activation. Both signal 1 and signal 2 are necessary for NLRP3 inflammasome activation. Signal 1 is activated by toll-like receptor (TLR) ligand, mediated by MyD88, caspase-8, FADD, and NF-κB, and leads to the upregulation of NLRP3 and pro-IL-1β. Signal 2 promotes the assembly of ASC and pro-caspase-1 and leads to activation of the NLRP3 inflammasome complex. A number of DAMP or PAMP, including K+efflux, pore-forming channels or toxins, Ca2+influx, ROS, mtDNA, have been proposed as the key mechanism of signal 2 activation. Once activated the NLRP3 inflammasome causes the activation of caspase-1 which cleaves the precursor proforms of IL-1β and IL-18 into their mature forms.
图2 NLRP3炎症小体激活机制

1.3.3溶酶体损伤导致组织蛋白酶B释放 溶酶体损伤造成的NLRP3炎症小体激活同样是炎症小体激活的主要方式之一，晶体或颗粒物等DAMP信号会诱导溶酶体破裂，导致蛋白水解酶等内容物释放到胞质中[22]。其中组织蛋白酶B可以直接与NLRP3炎症小体的PYD和NACHT结构域相互作用以激活NLRP3[23]。

以上的机制多数情况下会同时发生，且并没有一种单独通用的机制来解释炎症小体的激活。

2 MS与EAE

一直以来，MS被认为是一种复杂且难以辨别的自身免疫性疾病，病变主要累及大脑半球白质、小脑、脑干、脊髓和视神经[1]，其发病普遍认为是由穿过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)和血脊髓屏障(blood spinal cord barrier，BSCB)的CD4+T细胞所引起，免疫细胞会促进炎症发生、神经元脱髓鞘以及神经胶质增生和神经元变性[24]。活化的CD4+T细胞存在不同的分化状态，包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和Treg细胞，所有这些CD4+T细胞亚群都参与了MS的发病，相关细胞因子IL-17A、IL-23、IL-6等也与MS的发病有着密切关系[25-26]。除此之外，Haider等[27]认为小胶质细胞的活化、ROS的产生和氧化损伤也是驱动神经元脱髓鞘和神经退行性病变发生的关键。

EAE是常用的MS动物实验模型，应用该模型已开发了多种经FDA批准的治疗MS的药物。EAE在发病特征等多方面都与MS相似，两者均因BBB和BSCB受损，免疫细胞攻击CNS，导致病变部位出现大量炎性浸润物以及神经元脱髓鞘、神经胶质细胞增生和轴突损伤等病理特征，但EAE也并非能完全模仿MS的发病，如在进行性MS患者大脑中普遍存在与灰质和白质弥漫性损伤有关的氧化损伤就在狨猴和小鼠的EAE中均未发生[28]。

3 NLRP3炎症小体与MS和EAE

3.1NLRP3炎症小体及其下游分子广泛存在于MS和EAE中 因固有免疫系统最初执行许多适应性免疫的功能，因此，炎症小体在MS和EAE中发挥着许多重要作用。MS患者的外周血单核细胞中caspase-1和IL-18的表达量均有所增加[29]。同样，在EAE模型中，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β等多种NLRP3炎症小体相关分子的表达也有所增加[30]。利用ASC-/-和caspase-1-/-小鼠建立EAE模型，结果显示这些小鼠的发病情况同野生型小鼠相比均明显减轻；同样，由NLRP3-/-小鼠建立的EAE模型也表现出炎症反应减轻，髓鞘脱失情况下降的趋势[31]，且已有研究证实NLRP3炎症小体通过促进炎症细胞向CNS迁移来控制疾病进展[32]。由此可见NLRP3炎症小体在MS和EAE的发病中起着重要作用。

3.2EAE发病中影响NLRP3炎症小体激活的细胞因子 在EAE发病中细胞因子会影响NLRP3炎症小体的激活。由树突状细胞表达的胞外核苷酸酶CD39可以水解胞外ATP，使得胞外ATP造成的促炎症环境转变为腺苷诱导的抗炎症环境，从而抑制NLRP3炎症小体的激活[33]。近期的一项研究显示，阻断CD47也能影响NLRP3在EAE中的激活，在CD47缺陷时会导致一氧化氮(nitric oxide，NO)增加，NO会抑制NLRP3依赖性IL-18的产生[34]。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)是炎症小体的正向调节物，通过增强ASC和pro-IL-1β的表达来增加IL-1β的释放，产生GM-CSF的B细胞亚群参与了MS的发病，并加剧了髓系炎症反应[35]。与GM-CSF对炎症小体的正向调节不同的是，干扰素β(interferon β，IFN-β)会抑制NLRP3炎症小体的激活，目前IFN-β已经成为治疗MS的一线药物[36]。上述这些细胞因子都对NLRP3炎症小体有重要的调控作用。

3.3IL-1β在MS和EAE中作用 在EAE的初始阶段，抗原呈递细胞诱导CD4+T分化为Th1和Th17，从而将固有免疫反应和适应性免疫反应连接起来[37]。T细胞抗原受体激活pro-IL-1β表达，促使ASC从细胞核转运到细胞质，极化的Th17细胞表达IL-1受体(IL-1 receptor，IL-1R)，而后产生活化的IL-1β，值得注意的是，此时IL-1β是由ASC-NLRP3依赖性途径中的caspase-8所激活[37]。IL-1β在MS和EAE的发病早期穿过BBB进入脑脊液(cerebro-spinal fluid，CSF)和CNS，并且能促进其它细胞因子和免疫细胞也穿过BBB[38]。微血管中的内皮细胞通过对损伤刺激和细胞因子的反应参与了神经炎症，受到刺激后内皮细胞以IL-1R依赖途径上调黏附分子的表达，使中性粒细胞黏附到内皮细胞，并从血液迁移到CNS组织内，而使用神经调节素-1β可以减少中性粒细胞的黏附及IL-1β的影响[39]。在MS和EAE中IL-1β的来源并不相同，在小鼠的EAE模型中IL-1β是由浸润病灶的单核巨噬细胞产生而并非小胶质细胞；而在人和恒河猴的MS中，IL-1β似乎是由病变相关的小胶质细胞释放，而并非来自中性粒细胞或单核巨噬细胞[40-41]。并且MS患者CSF和血液中IL-1β的水平与疾病的易感性、病情进展和严重程度有关[42]，而IL-18也被认为与MS发病程度有关[43]。

4 针对NLRP3炎症小体的治疗方案

4.1使用IFN-β的治疗方案 目前，FDA已批准十多种治疗MS疾病的修饰类药物，在5种一线药物中，3种为IFN-β。IFN-β通过IL-10的自分泌作用减少pro-IL-1β产生[44]。此外，IFN-β还可作用于单核巨噬细胞的Ⅰ型干扰素受体，激活细胞因子信号转导抑制因子 1(suppressor of cytokine signalling 1，SOCS1)，SOCS1抑制Rac1活化和ROS生成后，NLRP3炎症小体的活性也随之受到抑制[30]。研究显示，MS患者接受IFN-β治疗后，其单核巨噬细胞产生IL-1β的水平要远低于健康人群，同时NLRP3在mRNA水平上也有下降[45]。然而也有研究表明IFN-β在MS和EAE治疗的应用中存在限制，即只有在NLRP3依赖性的MS或EAE中才能发挥治疗效果[36]。

4.2针对NLRP3上游激活通路的阻断剂 格列本脲是第1个被发现在体外具有抑制NLRP3激活作用的磺酰脲类药物，它可抑制LPS和ATP诱导的caspase-1的激活和IL-1β的分泌[46]。JC-171作为一种羟基磺酰胺类似物，是一种特异性NLRP3炎症小体抑制剂，具有预防和治疗EAE的作用[47]。丙磺舒作为一种 Pannexin-1通道阻滞剂，普遍用于治疗高尿酸血症和痛风，但其同时可以降低大鼠星形胶质细胞中NLRP3和caspase-1的表达[48]。青蒿素已被证实可以通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，并且在动物模型中表现出对于NLRP3炎症小体的抑制[49]。此外，β-羟丁酸通过阻止K+外流、内质网应激和ASC-NLRP3寡聚化来抑制NLRP3炎症小体活化[50]。3，4-亚甲二氧基-β-硝基苯乙烯是一种新型酪氨酸激酶抑制剂，能特异性阻止NLRP3和ASC的寡聚化，但不能阻断NLRP3激动剂诱导的K+外流[51]。

4.3以NLRP3下游效应分子为靶点的治疗 α1抗胰蛋白酶可以通过选择性阻断NLRP3以减少IL-1β表达[52]。Coll等[53]使用二芳基磺酰脲类化合物MCC950同样抑制了IL-1β表达，减轻了EAE的发病程度，降低了EAE模型鼠的死亡率。Mckenzie等[54]的实验证明用小分子药物VX-765可以抑制caspase-1，使得CNS中炎症小体和细胞焦亡相关蛋白表达减少，轴突损伤减轻，神经功能有所改善，其作用原理是通过转染GSDMD的siRNA抑制GSDMD的表达，进而抑制小胶质细胞焦亡。此外，还可以通过骨髓源神经干细胞[55]和牙周膜干细胞分泌物[56]设计针对EAE的治疗方案。

5 小结

尽管EAE和MS并不是完全相同的疾病，但是通过对EAE的研究，依然可以为MS的治疗提供一些借鉴；而且EAE模型的建立直观地展现了NLRP3炎症小体在自身免疫性神经炎症中的作用。虽然NLRP3炎症小体在MS和EAE发病中的作用已被逐步认识，但是还有许多问题亟待解决：是否还有别的NLRP3炎症小体激活物？是否有一个共同的机制来激活NLRP3炎症小体？在不同的病灶部位NLRP3炎症小体是如何参与发病的？能否针对NLRP3炎症小体的自身组份(如ASC等)而不仅是针对其下游细胞因子(如IL-1β)设计治疗方案？随着我们对NLRP3炎症小体认识的不断深入，必将对MS和其它同类的炎性自身免疫性疾病的治疗提供更有效的策略。