丁苯酞对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的治疗作用

张林，白俐，邓海娟，黄桑，邓群，曾昭智

(1.广州新海医院重症医学科，广东 广州 510300； 2.广东药科大学实验动物中心，广东 广州 510006)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一种病因不明、发病机制不清的致死性弥漫性肺间质疾病，以各类炎症细胞在肺间质浸润、纤维母细胞增生及纤维结缔组织沉积于肺间质为特征。IPF患者中位存活时间2～5年，5年存活率仅为20%[1]，严重危害人类健康。目前临床针对IPF的治疗尚无特效疗法，主要依靠免疫抑制剂治疗，但不良反应较大，部分患者治疗依从性较差，不能从根本上治疗该疾病，因此迫切需要寻找治疗肺纤维化有效、安全、副作用小的药物。研究表明，氧化应激反应在IPF发生发展中发挥了重要作用，氧自由基通过参与肺组织细胞内的氧化还原反应，诱导促炎因子产生， 影响细胞免疫活化状态和基质金属蛋白酶表达，从而损伤肺泡上皮细胞、导致胞外基质沉积、引起肺间质纤维化，因此，肺纤维化发病机制可能与细胞因子网络调节紊乱、抗氧化系统失衡、肺泡上皮细胞凋亡过度等因素有关[2-5]。丁苯酞(NBP)是从芹菜籽内所提取，通过人工合成而得的消旋类化合物，其结构与天然芹菜籽内的左旋芹菜甲素一致。研究发现，丁苯酞具有抗血小板聚集、促进血管生成、改善循环、减少氧自由基生成、抗凋亡等作用[6-9]，故推测丁苯酞对肺纤维化具有一定的治疗作用。为此本研究尝试用丁苯酞对博来霉素诱导肺纤维化小鼠进行干预，探讨其对肺纤维化小鼠模型的治疗作用，为肺纤维化的药物治疗提供新的思路和实验依据。

1 材料

1.1 药物与试剂

丁苯酞软胶囊(恩必普有限公司，批号：118180427)；IL-1β、TNF-α、MDA、SOD ELISA检测试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司，批号：201905)；硫酸博来霉素(麦克林，批号：B802467)；中性甲醛溶液(广州化学试剂厂，批号：20150722)；PBS磷酸盐缓冲剂[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司，批号：8118378]；玉米油(麦克林，批号：201424)；生理盐水(广东科伦药业，批号：H18091601)。

1.2 主要仪器

FA2004B电子天平(上海精科天美)；HZT-A1000电子天平(厦门华志)；TC-120C++智能程控生物组织自动脱水机(湖北泰维)；TB-718L生物组织自动包埋机(湖北泰维)；生物组织全自动染色机，TR-180Ⅰ(湖北泰维)；RM2235切片机(德国徕卡)；AE2000倒置显微镜(厦门麦克奥迪)；HCP246恒温培养箱(德国Memmert)；3K15冷冻离心机(德国SIGMA)；Infinite 200 pro酶标仪(瑞士tecan)；Forma 902超低温冰箱(美国Thermo)；LUK1801005自动样品快速研磨仪(广州露卡)；移液枪(Genex Beta)；JY92-IIN超声仪(宁波新芝)；DHG鼓风干燥箱(上海一恒)。

1.3 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2014-0007。实验期动物饲养在广东药科大学实验动物中心屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2017-0125。

2 方法

2.1 肺纤维化小鼠模型的建立[10]

C57BL/6小鼠腹腔注射硫酸博来霉素35 mg/kg(硫酸博来霉素用生理盐水溶解)，1周2次，连续注射8次，建立肺纤维化小鼠模型。

2.2 分组及给药

取同批24只正常小鼠作为正常对照组；选取建模成功的小鼠48只，随机分成模型组和丁苯酞治疗组各2组，每组动物12只， 正常对照组和模型组灌胃实验专用玉米油10 mL/kg，丁苯酞治疗组灌胃丁苯酞180 mg/kg(根据临床用药折算)，每天1次，分别连续14 d和28 d，丁苯酞用实验专用玉米油稀释混悬。分别于末次给药24 h后处死对应各组小鼠12只进行相应指标的测定。

2.3 观察指标

2.3.1 小鼠体质量测定 给药前和末次给药24 h后进行小鼠体质量测定。

2.3.2 肺指数测定 分别于末次给药24 h后取各组小鼠全肺称质量，并按如下公式计算肺指数:肺指数=肺质量(mg)/体质量(g)。

2.3.3 肺湿/干质量测定 取左肺称质量，置烘箱60 ℃烘72 h，再次称质量，进行湿/干质量比计算，以此判别大鼠肺部的水肿程度。

2.3.4 肺组织形态学评价 给药14 d和28 d各组小鼠的右肺上叶经10%(φ)甲醛溶液固定，按常规方法制作石蜡病理切片，染色镜检。每只小鼠病理切片随机选择1个观察视野，根据Hubner等[11]的方法对肺纤维化程度进行评分。0分：无纤维化，肺泡结构正常；1分：散在轻度纤维化灶，肺泡间隔厚度≤3倍正常值，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄，但无成团肺纤维化；2分：明显的肺纤维化改变，肺泡间隔厚度>3倍正常值，并伴有绳结样改变，但病变未融合，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄，但无成团肺纤维化；3分：连续肺纤维化，肺泡间隔厚度>3倍正常值，部分肺泡腔扩大，肺泡壁变薄；4分：单个成团肺纤维化灶，病灶范围<10%视野；5分：融合成团肺纤维化灶，病灶范围10%～50%视野，肺形态结构严重受损但还能依稀可见；6分：大片融合成团肺纤维化灶，病灶范围>50%视野，大部分肺泡间隔消失，大部分肺结构毁损；7分：肺泡内几乎充满成片的纤维组织，肺泡间隔消失，但仍可见至少5个气泡样改变；8分：满视野成团的纤维组织。

2.3.5 血清IL-1β、TNF-α含量测定 分别于给药14 d和28 d后小鼠眼眶静脉采血，2 000 r/min离心10 min取血清，ELISA 法测定IL-1β、TNF-α水平，含量测定步骤按照ELISA试剂盒说明书操作。

2.3.6 肺组织中MDA、SOD含量测定 分别于给药14 d和28 d后处死小鼠取右肺下叶，按照一定的比例加入PBS制成10%的组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min取上清液测定肺组织中MDA、SOD的含量，含量测定步骤按照ELISA 试剂盒说明书操作。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 丁苯酞对肺纤维化小鼠体质量的影响

与模型组比较，正常对照组、丁苯酞治疗组小鼠在给药14 d和28 d后其体质量差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3.2 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺指数的影响

与模型组比较，正常对照组在给药14 d和28 d后其肺指数差异有统计学意义(P<0.01)，而丁苯酞治疗组差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)，提示丁苯酞对肺纤维化小鼠肺指数无明显影响。

3.3 丁苯酞对肺纤维化小鼠湿/干质量比的影响

与模型组比较，正常对照组给药14 d后的左肺湿质量、左肺干质量和给药28 d后的左肺干质量、肺湿/干质量比差异有统计学意义(P<0.01)，而丁苯酞治疗组差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)，提示丁苯酞对肺纤维化小鼠湿/干质量比无明显影响。

表1 丁苯酞对肺纤维化小鼠体质量的影响Table 1 Effect of butylphthalide on the weight in mice with pulmonary fibrosis

表2 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺指数的影响Table 2 Effect of butylphthalide on the lung index in mice with pulmonary fibrosis

与模型组比较:**P<0.01。

表3 丁苯酞对肺纤维化小鼠湿/干质量比的影响Table 3 Effect of butylphthalide on the wet/dry ratio in mice with pulmonary fibrosis

与模型组比较:**P<0.01，*P<0.05。

3.4 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺组织形态学的影响

肉眼可见，模型组小鼠双肺体积明显增大、充血水肿、肺外周可见片状出血。经丁苯酞治疗后，肺表面血红色区减少，水肿和充血大部分消失，接近正常组。光镜下正常组肺泡腔完好，肺泡腔内无分泌物，几乎无肺水肿，肺泡壁结构完整，支气管上皮无变形和管周炎，无纤维化。模型组肺泡腔消失，肺泡腔内有浆液性渗出物及大量炎症细胞、红细胞渗出，肺泡间隔厚度增加和肺纤维化明显。丁苯酞治疗后，支气管变形等现象明显减轻或者消失，肺泡炎症细胞和肺间质炎症细胞明显减少，纤维化明显减轻，见图1。与模型组相比，丁苯酞治疗组给药14 d和28 d后其肺纤维化程度均有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

A.正常对照组(给药14 d); B.模型组(给药14 d); C.丁苯酞治疗组(给药14 d); D.正常对照组(给药28 d); E.模型组(给药28 d); F.丁苯酞治疗组(给药28 d)

图1丁苯酞对肺纤维化小鼠肺组织病理学影响

Figure1Effect of butylphthalide on the lung histopathology in mice with pulmonary fibrosis (HE,100×)

3.5 丁苯酞对肺纤维化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影响

与模型组相比，正常对照组和丁苯酞治疗组给药14 d和28 d后小鼠血清的IL-1β和TNF-α水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；丁苯酞治疗给药28 d小鼠血清的IL-1β水平明显低于14 d的水平，差异有统计学意义(P<0.01)，见表5。

表4 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺纤维化程度评分的影响

组别剂量/(mg·kg-1)肺纤维化/分给药14 d给药28 d正常对照组-0.58±0.67∗∗0.67±0.65∗∗模型组-3.17±1.112.92±1.00丁苯酞治疗组1801.75±0.62∗∗1.67±0.65∗∗

与模型组比较:**P<0.01。

3.6 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺组织中MDA和SOD含量的影响

与模型组相比，正常对照组和丁苯酞治疗组给药14 d和28 d后小鼠肺组织中MDA含量显著降低，SOD含量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；丁苯酞治疗给药28 d小鼠肺组织中SOD含量明显高于14 d的水平，差异有统计学意义(P<0.01)，见表6。

4 讨论

理想的肺纤维化动物模型必须能复制典型普通型间质性肺炎的组织学特征，肺纤维化持续或不可逆进展。博来霉素获取途径便利、可重复性强，成为目前最常用的诱导肺纤维化的药物[10]；C57BL/6小鼠对博来霉素最敏感，是目前最常用的肺纤维化实验动物，通过腹腔注射博来霉素建立稳定的C57BL/6小鼠肺纤维化模型，该方法操作简单，可重复性好，成模时间短，病理及相关细胞因子的改变与人类IPF类似[10，12-14]。本实验中小鼠连续注射博来霉素8次后出现肺充血水肿、炎症细胞，肺泡间隔厚度增加，纤维化明显等症状，表明博来霉素诱导的肺纤维化小鼠造模成功。经丁苯酞治疗后，肺水肿现象明显减轻，炎症细胞明显减少，纤维化症状减轻，肺纤维化程度评分分值明显降低，表明丁苯酞能减轻肺纤维化小鼠肺部病变，降低纤维化程度，对其有一定治疗作用。

表5 丁苯酞对肺纤维化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影响Table 5 Effect of butylphthalide on the levels of blood IL-1β and TNF-α in mice with pulmonary fibrosis

与模型组比较:**P<0.01；与给药14 d对应指标比较：##P<0.01。

表6 丁苯酞对肺纤维化小鼠肺组织中MDA和SOD含量的影响Table 6 Effect of butylphthalide on the levels of MDA and SOD in mice with pulmonary fibrosis

与模型组比较:**P<0.01；与给药14 d对应指标比较：##P<0.01。

炎症反应在肺纤维化发生发展过程中具有重要意义，IL-1β、TNF-α因子介导造成肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞的损伤[15]。本实验发现肺纤维化小鼠模型中IL-1β和TNF-α大量表达，表明小鼠肺纤维化与炎性因子释放表达有关，经过丁苯酞治疗后IL-1β和TNF-α水平明显下降，这与其他文献研究结果相符[15-16]，提示丁苯酞可能通过降低血清中的IL-1β和TNF-α炎症因子产生，减轻肺纤维化小鼠的炎性反应，阻碍或者延缓肺水肿和纤维化的形成，从而达到对肺纤维化小鼠模型的治疗作用，但其具体通过何种调节机制和信号通路来达到干预保护作用，有待于后期进一步实验研究。给药28 d小鼠血清的IL-1β水平明显低于14 d的水平，表明丁苯酞治疗28 d比治疗14 d更能达到控制炎症因子的水平。

博来霉素通过与金属离子螯合作用后使氧分子生成氧自由基，最终导致过氧化物的大量生成，过氧化物在肺纤维化形成中起到了重要的作用，机体在正常情况下，氧化和抗氧化作用处于动态平衡中。当机体遭受氧化应激时，脂质过氧化物MDA的含量将明显增加，而抗氧化物如SOD水平明显降低[13，17]。本研究表明，丁苯酞应用后小鼠肺组织中MDA的含量明显降低，SOD水平明显提高，说明丁苯酞可能有助于对氧自由基的清除，因此推测丁苯酞对肺纤维化的保护作用与其增加肺脏中的抗氧化能力有关，但其具体调节机制有待于后期进一步研究。丁苯酞治疗给药28 d小鼠肺组织中SOD含量明显高于14 d的水平，说明给药28 d小鼠肺脏中的抗氧化能力强于给药14 d的抗氧化能力，表明丁苯酞治疗28 d的抗氧化效果好。

综上所述，丁苯酞可通过降低血清中炎症因子的产生和增强肺组织的抗氧化能力，阻碍或者延缓肺水肿和纤维化的形成，从而达到对肺纤维化小鼠模型的治疗作用，且治疗给药28 d的效果好。