不同建模方法对链脲霉素诱导1型糖尿病成模率的影响

王乐旬，吴惠娟，张盛昔，荣向路，郭姣

(广东省代谢病中西医结合研究中心/广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室/粤港澳联合代谢病重点实验室/广东药科大学中医药研究院，广东 广州 510006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)的全球患病率逐年上升，已成为威胁人类健康的主要疾病之一，主要分为1型(T1DM)和2型(T2DM)。T1DM作为目前高发的一种慢性胰岛素依赖性自身免疫性疾病，主要病理表现为T淋巴细胞浸润胰腺，导致胰岛β细胞破坏，进而使其丧失合成和分泌胰岛素的功能[1]。然而，临床上对T1DM的防治措施尚不完善，还需要对其进行深入的研究。因此，建立较理想的动物模型对研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一种从链霉菌中提取的抗生素，因其具有毒性低、用药量小、高特异性的破坏胰岛β细胞等优点，为目前世界范围内最常用的诱发动物出现糖尿病的化学诱导剂[2]。STZ诱导糖尿病的发生及类型与鼠的种系、性别、用药剂量和次数有关[2]。经典的诱导T1DM方法是多次小剂量STZ注射，但用药剂量、是否饥饿、模型成功率以及小鼠死亡情况文献报道不一[3-5]。本研究采用多次腹腔注射STZ或先饥饿然后给予腹腔注射STZ诱导C57BL/6小鼠T1DM，以筛选模型成功率较高、小鼠死亡率较低的造模方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～10周的雄性C57BL/6小鼠购自广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002。小鼠饲养在广东药科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2017-0125，室内温度25 ℃，相对湿度70%～90%，普通饲料喂养，自由饮水和摄食。

1.2 试剂与仪器

分析纯的柠檬酸和柠檬酸钠购于天津市大茂化学试剂厂;STZ购自美国Sigma公司；羊血清和DAB显色试剂盒购自碧云天生物技术公司；胰岛素一抗为北京博奥森生物技术有限公司产品；羊抗兔HRP标记的二抗为Thermo Scientific公司产品；ONETOUCH ultraeasy血糖仪及试纸购自美国Johnson & Johnson公司；BX51WI显微镜为日本Olympus公司产品；Vectra显微镜分析软件为美国PE公司产品。

1.3 溶液的配制

柠檬酸盐缓冲液：称取柠檬酸2.1 g加双蒸水100 mL配成A液，柠檬酸钠2.94 g加双蒸水100 mL配成B液，将A、B液按1∶1(V∶V)混合，严格调节pH在4.2～4.5，用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌。

STZ溶液：称取STZ装于一干燥的灭菌管中，外用锡纸包好，用预冷的柠檬酸盐缓冲液溶解，配成质量浓度为10 mg/mL的溶液，现配现用，30 min内用完。

1.4 分组与建模

小鼠随机分对照组(7只)、实验组一(经典造模方法，12只)、实验组二(12只)以及实验组三(常用造模方法，11只)。实验组一[4-7]：未禁食，腹腔注射剂量为50 mg/kg的STZ，连续5 d；实验组二：不禁食，腹腔注射剂量为50 mg/kg的STZ，连续4 d，最后1天注射STZ的剂量加倍，为100 mg/kg；实验组三[3,8]：每天先禁食12 h，然后腹腔注射50 mg/kg的STZ，连续5 d。对照组注射与实验组等体积(5 mL/kg)的柠檬酸盐缓冲液。

1.5 模型观察指标

注射STZ后每天观察并记录小鼠的一般状况和死亡情况，一般状况主要包括精神状态、毛发颜色、运动情况和垫料有无尿湿等，并及时更换尿湿的垫料；每天测量各组小鼠的体质量、摄食量和饮水量；最后1次注射后每周测量1次随机血糖，连续4周，随机血糖值≥15 mmol/L为建模成功[8-9]。比较各组的成模率和死亡率、成模小鼠的血糖值变化和体质量变化等。

1.6 免疫组织化学

实验结束后，脱臼处死小鼠，取胰腺组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片。对胰腺石蜡切片进行烤片、脱蜡和脱水后，利用枸橼酸缓冲液加热进行抗原修复；正常羊血清工作液封闭，胰岛素一抗湿盒孵育过夜；PBS洗涤3次，每次5 min后，孵育生物素标记二抗；PBS洗涤3次，每次5 min；二氨基联苯胺(DAB)染色后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥和封片；然后显微镜观察并拍照，并利用显微镜自带分析软件分析胰岛面积。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠的一般情况

对各组小鼠日常活动状态观察发现，对照组小鼠毛发干净、顺、有光泽，精神状态良好，比较活泼，反应灵敏。各实验组均有不同程度地表现为活动少、精神萎靡、毛发欠光泽、易脱毛、反应迟钝等现象，这些情况又以实验组二的表现最为明显。

注射STZ第3天起饮水量和进食量开始增加。选择第4周对每天摄食和饮水情况进行统计，结果如图1所示，实验组的摄食量显著高于对照组(实验组一和三：P<0.05；实验组二：P<0.01)，所有实验组的饮水量均显著高于对照组(P<0.01)。从饮水量上看，实验组二的饮水量是最高的，远高于实验组一和实验组三(P<0.01)。实验组从STZ注射后第3天起出现多尿现象，3个模型组的垫料明显比对照组垫料的湿度大。结果显示多饮多食症状明显。

2.2 不同建模方法对小鼠体质量的影响

对照组的各小鼠体质量逐步增长；在STZ注射后第1周，各实验组与对照组的小鼠体质量差异无统计学意义。实验组二的小鼠体质量与对照组相比从第2周开始有了显著差异(P<0.05)，这种差异一直维持到第4周实验结束(P<0.01)；而实验组一的小鼠体质量与对照组相比，在第3周才出现显著性差异(P<0.05)，并且一直到实验结束(P<0.05)；实验组三的体质量差异变化不大，见表1。从第2周开始，实验组一和二的体质量呈现下降趋势，而实验组三的体质量下降趋势不明显。

ABCDABCD5.04.03.02.01.00.0摄食量/g饮水量/mL15.010.05.00.0******##**##**

A.对照组； B.实验组一； C.实验组二； D.实验组三。与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与实验组二比较：##P<0.01。

图1各组小鼠的摄食及饮水量

2.3 不同建模方法对小鼠随机血糖的变化

通过不同时间测得的随机血糖结果显示，和对照组相比，实验组一和二的随机血糖在注射STZ后的第1周就显著高于对照组的血糖(P<0.05)，这种升高一直持续到实验结束(实验组一：P<0.05；实验组二：P<0.01)。而实验组三的血糖从第2周开始明显高于对照组(P<0.05)，第3周有升高趋势，这种趋势持续到实验结束(P<0.05)。另外，不同实验组间的血糖也有差异。实验组三的血糖从第2周开始显著低于实验组二的血糖(P<0.05)，且这种趋势一直存在。见表2。

表1 各组小鼠建模后体质量

组别n1周2周3周4周对照组723.89±1.8124.97±1.8525.56±2.0125.81±2.20实验组一1223.13±1.3723.63±1.4722.60±2.39∗22.93±1.93∗实验组二1222.78±1.3523.03±1.44∗22.15±1.68∗∗22.28±1.92∗∗实验组三1122.52±1.5523.85±1.0623.26±1.3323.54±1.39

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

2.4 不同方法的建模成功率

根据随机血糖值超过15 mmol/L即确定为1型糖尿病，分析了每次测量的血糖结果，如表3所示。在这3种不同方式建模中，实验组二在第1周的时候成功率最高，为41.7%，且于第2周有11只小鼠的血糖超过15 mmol/L(成功率为91.7%)，数量和血糖值均一直维持到实验结束。其次，实验组一小鼠的成模率在第3周才达到83.3%，第4周也并未增加。而实验组三的小鼠在第1和第2周时的成模率为36.4%，第3周和第4周分别比前2周增加了2只和3只小鼠，于第4周时成模率达到63.6%，在3种建模方式中成模率最低。

另外，在整个建模过程中，实验组二在第3周死亡1只小鼠，其余两组均未发生小鼠死亡的情况。

表2 各组小鼠建模后随机血糖值

c/(mmol·L-1)

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与实验组二比较：#P<0.05。

表3 各组小鼠成模率

Table3Modeling rate of mice in each group

%

2.5 模型鼠的胰腺改变

结果如图2所示，和对照组相比，模型组小鼠的胰岛普遍缩小(实验组一和二，P<0.01；实验组三，P<0.05)；形态上胰岛细胞显著减少且排列不规则。

A.对照组； B.实验组一； C.实验组二； D.实验组三。与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图2各组小鼠胰腺免疫组化

Figure2Immunohistochemistry of pancreas in mice of each group (200×,n=7)

3 讨论

近年来随着我国居民生活水平的提高，糖尿病的发病率呈上升趋势，青少年的发病率也逐年升高。T1DM作为青少年常见疾病类型，可引起酮症酸中毒、昏迷和糖尿病肾病等并发症，对人类健康造成巨大影响。因此，对糖尿病的发病机制、预防与治疗等研究成为热点。为了克服现有模型的不足，构建简单易操作、重复性好的糖尿病动物模型显得尤为重要。

目前常用糖尿病模型主要有药物诱导模型、胰腺切除模型以及自发性糖尿病动物模型等[7]，STZ是最为常用的药物诱导剂。因STZ对胰岛β细胞具有高度特异的选择杀伤作用，故用STZ造模的成模率高，操作简便，且小剂量多次注射给药可引发T细胞介导的β细胞损伤，出现自身免疫系统紊乱[2]。这种损伤与人类T1DM发病机制相似，因此受到格外关注。STZ诱导糖尿病注射方法有多种，腹腔注射较尾静脉注射操作简单、准确快速，因此在本研究中，采取腹腔给药途径构建糖尿病模型。对于给药剂量，国内外的研究多采用30～60 mg/kg[3,10-12]。本研究中选择了50 mg/kg作为基础剂量进行注射，然后通过腹腔连续注射5 d，成功构建1型糖尿病模型。

对于血糖的检测和标准，研究报道也不一致。有研究检测空腹血糖，血糖值定为大于16.65 mmol/L[13]、15 mmol/L[8]或11.1 mmol/L[5,14]认为糖尿病模型构建成功。也有研究检测随机血糖，血糖值大于16.7 mmol/L[3,15]、15 mmol/L[9]、13.9 mmol/L[10]或11 mmol/L[16]作为模型成功的标准。本研究选择了操作较为简单的随机血糖检测，并且将模型构建标准定为血糖值大于15 mmol/L。随机血糖检测操作简单、方便易行，不用对动物进行饥饿处理，减少对动物不必要的干预，符合动物的伦理要求。

对于血糖的检测时间，各报道并不一致。有些研究显示，在最后一次STZ注射后的3 d检测血糖高于标准之后就判定为模型构建成功[3,9,17-18]；有些研究显示，在末次注射后的1周检测血糖值高于判定标准后认为模型构建成功[12-13,15]。考虑到STZ注射后3 d时间过短，胰岛β细胞的损伤需要一定的时间，正如一些研究中显示3 d时检测的血糖低于1周时的血糖[13]，所以本研究选择从注射后1周开始测量血糖，将血糖值大于15 mmol/L定为模型构建成功。

有研究[8]显示，注射STZ前禁食与否对模型的成功构建有很大影响。如禁食可以增加建模的成功率。10～20 h建模成功率最高，禁食时间过短或过长，建模成功率均下降[3,12]。但另外一些研究表明，在注射STZ前不禁食也可达到较高的建模成功率[9-10,15]。本研究比较了禁食12 h与不禁食对造模成功率的影响。通过4周的观察和检测，发现禁食组的成模率(63.6%)低于未禁食组的成模率(83.3%)。造成这种现象的原因可能是禁食导致血糖和胰岛素的分泌下降，进而引起胰腺β细胞对葡萄糖类似物STZ的摄入下降所致[2,12]。

另外，本研究也对比了未禁食时5 d连续基础剂量(50 mg/kg)注射和4 d基础剂量+1 d加大剂量(100 mg/kg)建模情况，发现最后1天STZ的剂量加倍后能够显著提升糖尿病模型的建模成功率(100%)。胰腺的免疫组化结果也提示，末次加大剂量后能够在前期损伤的基础进一步杀伤β细胞[2]。末次剂量加倍处理使血糖升高更快，水平也更高，和另外两组相比，血糖幅度变化小。小鼠的大体形态、饮食和饮水、血糖水平等更符合糖尿病的模型标准。在模型鼠的死亡方面，除了实验组二有1只死亡外，其余两组没有小鼠死亡。

综上，综合成模率和死亡率，腹腔注射STZ 4 d基础剂量(50 mg/kg)+1 d剂量加倍(100 mg/kg)，无需禁食，建成的糖尿病模型较为稳定，成模率及成活率均较高，可作为1型糖尿病首选的建模方式。