膳食联合STZ诱导胰岛素抵抗的2型糖尿病大鼠模型的建立

桑延霞，张军军

(广东药科大学医药化工学院,广东 广州 510006)

全球约4.24亿人患有糖尿病，其中90%～95%患者为2型糖尿病[1]，建立2型糖尿病动物模型是筛选糖尿病药物及深入研究2型糖尿病及其并发症的基础。目前，2型糖尿病大鼠建模方法主要有化学试剂诱发、自发性筛选、转基因和基因敲除、特殊膳食诱导等[2-5]。单一化学试剂诱发法对剂量把控要求较高，剂量过低，不易成模，剂量过高，死亡率大[6-8]，易导致1型糖尿病。膳食诱导，耗时长，淘汰率高，造模成本高[9-11]。基因改造方法技术难度高，耗资大[12- 13]。目前多采用膳食诱导辅以低剂量STZ诱导构建2型糖尿病模型，但模型构建也受动物种类、年龄、性别、饮食、饲养环境、诱变剂量、禁食状态、诱导后的饮食状况等很多因素的影响[14-17]。本研究充分考虑了上述因素的影响，利用高糖高脂饮食诱发大鼠外周胰岛素抵抗，再以不同剂量的STZ诱导胰岛细胞的凋亡，最终建立一种符合2型糖尿病发病机制的动物模型。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

Elx800 酶标仪(Bio Tek)；微量血糖测定仪(Onetouch Ultra，Johnson)；ME104 电子天平(Mettler Toledo)。

1.2 试剂

STZ(Sigma公司)；胰岛素检测试剂盒(Blue gene公司，上海)；高糖高脂饲料(蔗糖20%+猪油10%+胆固醇2.5%+胆酸钠1% ，其余为维持料，广东省医学实验动物中心提供)；真空采血管(沧州永康医药用品有限公司)；葡萄糖、柠檬酸钠、乙醚均为国产分析纯试剂。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，4～5周龄，体质量90～100 g，广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2018-0002。

2 方法

2.1 模型的建立

喂养8周后，于注射STZ前2天，白天禁食16 h，测FPG、空腹胰岛素(FINS)。恢复正常饮食2 d，测定口服糖耐量(OGTT)。正常饮食2 d后，白天禁食16 h，称量体质量，L组、H组分别以30、60 mg/kg的剂量一次性腹腔注射用0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.4)配制的0.5%STZ，Control组注射1 mL的柠檬酸缓冲液，注射1 h后给食和0.5%的葡萄糖水。STZ诱导2周后，白天禁食16 h，测定体质量、FBG、FINS。恢复休养2 d后，测定OGTT。

2.2 FINS的测定

大鼠乙醚麻醉后，眼丛静脉取血，1 000g离心10 min，取上清，按试剂盒说明书测定血清胰岛素含量。

2.3 OGTT实验

STZ诱导2周后，全部大鼠白天禁食16 h后，将20%的葡萄糖溶液以2 g/kg的剂量灌胃，期间可自由进水，分别在0 min(给糖前)，给糖后30、60、120、180 min尾静脉采血测定血糖，绘制血糖-时间曲线，利用梯形法计算给糖2 h内血糖曲线下面积(GAUC)。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠体质量的变化

********#ControlLH48043038033028023018013080体质量/g0周4周8周10周

与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01；与低剂量STZ组比较：#P<0.05。

图1各组大鼠体质量的变化
Figure1Changes of body weight of rats in each group

3.2 各组大鼠FBG的变化

由图2可以看出，STZ注射前的8周内，各组间FBG差异均无统计学意义，且都在正常范围内，第10周(STZ注射后2周)时，L、H组FBG显著高于Control组(P<0.01)，分别为9.8、13.9 mmol/L，且H组也明显高于L组(P<0.05)，表明STZ对胰腺细胞造成了一定的损伤，导致血糖代谢异常。

181614121086420c(FBG)/(mmol?L-1)注射STZ****#ControlLH101202468t/周

与对照组比较：**P<0.01；与低剂量STZ组比较：#P<0.05 。

图2各组大鼠FBG的变化

Figure2Changes of fasting blood glucose of rats in each group

3.3 各组大鼠FINS的变化

由图3可以看出，高糖高脂诱导4周后，各组FINS差异无统计学意义。第8周，L、H组FINS水平明显高于Control(P<0.05)，出现高胰岛素血症。第10周(STZ注射2周后)，L、H组FINS水平较第8周显著下降(P<0.01)，但L组仍高于Control(P<0.05)，继续维持高胰岛素血症，而H组则低于Control(P<0.05)，出现低胰岛素血症，表明L、H组大鼠胰岛细胞受到了不同程度的损伤，且对STZ具有剂量依赖性。

##***10周8周4周ControlLH*5045403530252015100ρ(FINS)/(mU?L-1)**

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与低剂量STZ组比较：##P<0.01。

图3各组大鼠FINS的变化
Figure3Changes of fasting insulin of rats in each group

3.4 各组大鼠糖耐受的变化

图4第8周的OGTT显示，仅在给糖后第1小时，L、H组与Control组血糖的差异有统计学意义，其他时间点差异均无统计学意义。图5第10周OGTT显示，经STZ诱导后，L、H组在各采血点的血糖均显著高于Control(P<0.01)，且H明显高于L(P<0.05)。图6表明，第8周L、H组2 h血糖曲线下面积AUC都显著高于Control(P<0.05)，预示高糖高脂诱导使大鼠出现了一定程度的糖耐量受损；第10周L、H组的GAUC均明显高于第8周(P<0.01)，表明注射STZ后各组糖耐受的损伤加重。

**20181614121086420c(血糖)/(mmol?L-1)ControlLH100150200500t/min

与对照组比较：*P<0.05。

图4第8周时各组大鼠的OGTT (STZ注射前)

Figure4OGTT of rats in each group at 8 weeks (before STZ injection)

****#********#**#**#**#**35302520151050100150200500t/minControlLHc(血糖)/(mmol?L-1)

与对照组比较：**P<0.01；与低剂量STZ组比较：#P<0.05。

图5第10周时各组大鼠的OGTT (STZ注射后2周)

Figure5OGTT of rats in each group at 10 weeks (2 weeks after STZ injection)

ControlLH**#**6050403020100GAUC10周8周**#

与对照组比较：*P<0.05；与8周时比较：**P<0.01；与低剂量STZ组比较：#P<0.05。

图6各组大鼠OGTT 2 h内GAUC(STZ注射后2周)

Figure6GAUC within 2 hours of OGTT in rats of each group (2weeks after STZ injection)

4 讨论

高热量饮食导致的肥胖使机体对胰岛素促进的葡萄糖摄取效率下降，机体代偿性分泌过多胰岛素产生胰岛素抵抗[22-23]，同时糖毒性和脂毒性影响胰岛β细胞功能，造成胰岛素分泌障碍，最终形成2型糖尿病。

胰岛素抵抗和胰岛功能受损是2型糖尿病的典型病理生理特征[24]，高热量饮食仅能诱导约50%的大鼠发生胰岛素抵抗，若用全部高热量饮食的大鼠进行STZ造模，必定有部分糖尿病大鼠无胰岛素抵抗而更类似1型糖尿病。因此本研究对4月龄雄鼠进行高糖高脂饮食诱导后，剔除食源诱导肥胖抵抗大鼠，选出有胰岛素抵抗的食源性肥胖大鼠，再进行STZ诱导，使模型更符合2型糖尿病的病理生理机制。本研究中，高糖高脂饮食8周大鼠出现了胰岛素抵抗，但血糖仍维持在正常水平，具有了早期糖尿病的特征。

腹腔注射不同剂量STZ后，胰岛细胞受到不同程度的损伤，60 mg/kg高剂量STZ严重导致胰岛β细胞功能性障碍，胰岛素分泌不足，致使血糖升高，糖耐量下降，体质量减轻，表现出1型糖尿病和晚期2型糖尿病的症状。30 mg/kg低剂量STZ对胰岛β细胞的损伤较轻，胰岛素分泌能力虽然有所下降，但血浆胰岛素仍显著高于对照组，继续保持胰岛素抵抗的症状，同时胰岛损致使血糖升高，达到糖尿病的诊断标准，使大鼠模型表现出早中期2型糖尿病的典型特征。

在2型糖尿病大鼠模型的构建中，动物性别、月龄、食源、造模方法等是影响模型成功率的主要因素。与多数文献报道的不同[6,9,15,21]，本研究使用4月龄雄鼠，缩短了造模时间，减少了内源性激素的干扰；遵循大鼠昼的生活习性，采用白天禁食的方式，同时注射STZ后及时给予低浓度葡萄糖水，避免低血糖造成的死亡，以上措施使成模率达到64%。

本研究表明，高热量饮食辅以60 mg/kg STZ诱导4月龄雄性大鼠易致1型糖尿病和晚期2型糖尿病；高热量饮食辅以30 mg/kg STZ诱导能更快形成具胰岛素抵抗的早中期2型糖尿病，并能提高成模率。