金边土鳖4种工艺样品对大鼠血液流变性及凝血功能的影响

李成，甘海宁，陈伟韬，陈玉兴，毕晓黎，占心佾

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510095； 2.广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)，广东 广州 510095； 3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

“虫类”药材在我国是一类特色的医药资源，其通常具有疗效高、活性强、潜力大、应用广等特点，在动物类中药材中占据重要地位[1]。 “虫类”药材具有多种功效且广泛应用于中药处方中[2]，在《神农本草经》、《金匮药略》、《本草纲目》等古代医药著作中以“蟅虫”入药，已有近2 000年的入药历史。金边土鳖为昆虫纲蜚蠊目姬蠊科昆虫，具有消瘀散结、抗凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效，妇科常用于逐瘀通结，内科常用于散结消癥，伤科常用于续骨疗伤，是中医临床中血瘀证的常用药[3-4]，临床上对抗血栓、祛风湿、抗肿瘤等都具有良好的作用[5]，已被收载于《广东省中药材标准》(第2册)[6]。国外对其研究报道较少，国内仅对其生物学、生殖系统及抗癌抗菌等药理作用进行过研究[7-8]。本文采用不同提取方法提取金边土鳖进行活血化瘀实验研究，为金边土鳖的临床应用提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药品

金边土鳖(广东环球制药有限公司，批号161213)；阿司匹林肠溶片[拜耳医药(上海)有限公司，批号SH00358]、10%水合氯醛、盐酸肾上腺素注射液(成都市科龙化工试剂厂，批号2016092901)；角叉菜胶(Sigma-Aldrich产品，批号SLBN6684V)；细菌脂多糖(International Laboratory产品，批号：374613)。

1.2 试剂

凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(批号1804056)、活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒(批号1803037)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒(批号 1803057)、纤维蛋白原(FIB)测定试剂盒(批号 348170718)，均为北京普利生仪器有限公司产品。

1.3 主要仪器

JJ500电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；JP-500B-8高速多功能粉碎机(永康市久品电器公司)；HH-6数显恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司)；RE-52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；LXJ-11B低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)；C2000-A高性能血凝仪(北京普利生仪器有限公司)；LBY-N7500A全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司)；L-600台式大容量低速离心机(江东仪器有限公司)；Varioskan Flash全波长多功能酶标仪(Thermo公司)。

1.4 实验动物

SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号SCXK(粤)2018-0002。

2 方法

2.1 金边土鳖提取方法及给药剂量

匀浆法：取金边土鳖粉末50 g(六号筛)，加3倍量蒸馏水用组织搅拌机匀浆20 min，再离心20 min，取上清液备用浓缩至0.50 g/mL。冷浸法[9]：取金边土鳖粉末50 g(六号筛)，每次加6倍量蒸馏水振摇3次，依次提取5 h、4 h、4 h，合并3次提取溶液，离心后浓缩至0.50 g/mL。水煮法：取金边土鳖50 g碾碎后加蒸馏水煎煮40 min，浓缩后用纱布过滤使其含生药0.50 g/mL。粉碎法：取50 g金边土鳖粉末(六号筛)，加100 mL蒸馏水制成混悬液，使质量浓度为0.50 g/mL。阿司匹林组剂量为4 mg/kg，金边土鳖各工艺样品高剂量为3.24 g/kg，低剂量为0.81 g/kg。

2.2 金边土鳖对正常大鼠全血比黏度及凝血功能影响

取SD大鼠100只，适应性喂养1周后，体质量分层随机分为对照组，阿司匹林组，匀浆高、低剂量组，水煮高、低剂量组，冷浸高、低剂量组，粉碎高、低剂量组，分组后每天上午各给药组按剂量灌胃给药，给药体积10 mL/kg，正常对照组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续5 d。末次给药前1 d，禁食24 h，末次给药后1 h，腹腔注射10%(φ)水合氯醛麻醉，腹主动脉取血测定凝血功能和全血比黏度。

2.3 金边土鳖对寒凝血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影响

根据文献[9-11]进行改进建立急性寒凝血瘀模型。取SD大鼠110只，适应性喂养1周后，体质量分层随机将110只大鼠按“2.2”分组、给药。末次给药前1 d，除正常对照组外，其余各组大鼠于灌胃给药后1 h皮下注射盐酸肾上腺素0.8 mL/kg 2次，2次注射时间间隔为4 h，第1次注射盐酸肾上腺素后2 h，注射大鼠放入3～5 ℃低温环境中30 min。末次给药前各组大鼠均禁食不禁水16 h，末次给药后1 h，麻醉取血测定凝血功能和全血比黏度。

2.4 金边土鳖对热毒血瘀模型大鼠全血比黏度及凝血功能影响

根据文献[12]进行改进建立热毒血瘀模型。SD大鼠110只同上分组，分组后正常对照组大鼠给予普通饲料饲养，其余各组大鼠喂饲高脂饲料，各给药组按剂量灌胃给药，给药体积10 mL/kg，正常对照组和模型组给予等体积蒸馏水，每天1次，连续5 d。实验第3天，除正常对照组外，其余各组均皮下注射角叉菜胶(10 mg/kg)，24 h后腹腔注射给予细菌脂多糖(100 μg/kg)。末次给药前禁食不禁水16 h，末次给药后1 h，各组大鼠麻醉取血测定凝血功能和全血比黏度。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 金边土鳖对正常大鼠凝血功能的影响

与对照组比较，冷浸法高剂量组、粉碎法低剂量组大鼠全血比黏度(低切10)明显降低(P<0.01)，粉碎法高剂量组降低(P<0.05)；匀浆法高剂量组、冷浸法高剂量组和粉碎法高、低剂量组大鼠全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；4种方法高低剂量组全血比黏度(高切150)均无变化(P>0.05)；匀浆法高剂量组、冷浸法高剂量组大鼠APTT明显延长(P<0.01)；阿司匹林组、匀浆法低剂量组、水煮法高、低剂量组、冷浸法低剂量组、粉碎法高、低剂量组APTT延长(P<0.05)；粉碎法高剂量组PT明显延长(P<0.01)；匀浆法高剂量组、冷浸法高、低剂量组，粉碎法高、低剂量组TT延长(P<0.05)，阿司匹林组、匀浆法低剂量组TT延长(P<0.05)；阿司匹林组、匀浆法高剂量组、冷浸法高剂量组、粉碎法高、低剂量组FIB明显降低(P<0.01),阿司匹林组、冷浸法低剂量组FIB降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 金边土鳖对正常大鼠全血比黏度及凝血功能的作用Table 1 Effect of Opisthoplatia Orientalis Burm. on blood viscosity and coagulation function of normal rats

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

3.2 金边土鳖对寒凝血瘀模型大鼠凝血功能的影响

与正常对照组比较，寒凝血瘀模型组全血比黏度(低切10、中切60、高切150)明显增加(P<0.01)；与寒凝血瘀模型组比较，冷浸法高剂量组全血比黏度(低切10)降低(P<0.05)；与寒凝血瘀模型组比较，阿司匹林组，匀浆法高、低剂量组，水煮法高、低剂量组，冷浸法高、低剂量组，粉碎法高、低剂量组全血比黏度(中切60)均降低(P<0.05)；与寒凝血瘀模型组比较，各实验组全血比黏度(高切150)无降低现象(P>0.05)；与对照组比较，寒凝血瘀模型组APTT明显缩短(P<0.01)；与寒凝血瘀模型组比较，水煮法高、低剂量组APTT明显延长(P<0.01)；阿司匹林组、匀浆法高剂量组、冷浸低剂量组、粉碎法高剂量组APTT延长(P<0.05)；与对照组比较，寒凝血瘀模型组PT无缩短现象(P>0.05)；与对照组比较，寒凝血瘀模型组TT明显缩短(P<0.01)；与寒凝血瘀模型组比较，各实验组TT明显缩短(P<0.01)；与对照组比较，寒凝血瘀模型组FIB明显增加(P<0.01)；与寒凝血瘀模型组比较，阿司匹林组、匀浆法低剂量组、水煮法低剂量组、冷浸法高、低剂量组FIB明显降低(P<0.01)，匀浆法高剂量组、水煮法高剂量组、粉碎法高、低剂量FIB降低(P<0.05)。结果见表2。

3.3 金边土鳖对热毒血瘀模型大鼠的影响

与正常对照组比较，热毒血瘀模型组全血比黏度(低切10、中切60)明显增加(P<0.01)；与热毒血瘀模型组比较，各实验组全血比黏度(低切10)均降低(P<0.05)；与热毒血瘀模型组比较，各实验组全血比黏度(中切60)明显降低(P<0.01)；与正常对照组比较，热毒血瘀模型组全血比黏度(高切150)未增加(P>0.05)；与正常对照组比较，热毒血瘀模型组APTT明显缩短(P<0.01)；与热毒血瘀模型组比较，冷浸法高剂量组、粉碎法高剂量组APTT明显延长(P<0.01)，阿司匹林组、匀浆法高、低剂量组、水煮法高剂量组、冷浸法低剂量组、粉碎法低剂量组APTT延长(P<0.05)；与对照组比较，热毒血瘀模型组PT缩短(P<0.05)；与热毒血瘀模型组比较，各实验组PT无变化(P>0.05)；与对照组比较，热毒血瘀模型组TT明显缩短(P<0.01)；与热毒血瘀模型组比较，水煮法高、低剂量组、冷浸法低剂量组、粉碎法低剂量组TT明显缩短(P<0.01)，匀浆高剂量组、冷浸高剂量组TT缩短(P<0.05)；与对照组比较，热毒血瘀模型组FIB明显增加(P<0.01)；与热毒血瘀模型组比较，各实验组FIB明显降低(P<0.01)。 结果如表3。

4 讨论

清代唐容川在《血症论》中记载：瘀血在经络脏腑之间，则为癥瘕，癥之为病，总是气和血胶合而成……”。现代中医认为，凡离经之血不能及时消散而瘀滞于人体组织内，或血液运行受阻，瘀滞于经脉或器官之内则称为瘀血。现代研究表明，血瘀证的形成与血液系统，特别是血小板、纤溶、抗凝血酶系统密切相关，存在血液流变性和微循环异常等病理生理改变。血瘀时，血液黏度大，流动性差，表现为浓、黏、凝、聚状态，血液有效灌注量少，影响了气血的运行[15-17]。

金边土鳖为中医临床治疗血瘀证的常用中药，常以水煎内服或以黄酒送服、或者烘焙磨粉后入药治疗血瘀证，临床效果较佳。本实验对金边土鳖采用水煮法、粉碎法、匀浆法和冷浸法作为提取方法制备不同样品，对比观察不同工艺样品的活血化瘀效果，可为临床应用金边土鳖提供多种更便利的使用方式，也可为金边土鳖中药新药开发应用提供更合理的制备制剂方式。

表2 金边土鳖对寒凝血瘀模型大鼠血流变及凝血功能的作用

组别剂量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4项APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常对照组-8.61±0.915.21±1.044.24±0.6928.20±5.1520.40±5.5725.82±4.26938.50±297.34寒凝血瘀模型组-15.19±2.75##8.15±1.32##5.87±1.26##14.32±1.93##14.09±1.5912.73±2.48##1548.46±234.84##阿司匹林组0.00410.60±2.726.36±0.86∗4.36±0.5420.88±4.10∗15.25±1.3622.49±2.40∗∗1032.26±207.75∗∗匀浆高剂量组3.2412.55±4.306.68±0.87∗4.47±0.5719.03±2.47∗15.81±1.1023.42±4.53∗∗1168.26±223.22∗ 低剂量组0.8111.74±3.546.67±0.91∗4.51±0.5517.70±1.9717.04±2.6921.90±1.43∗∗1100.80±180.68∗∗水煮高剂量组3.2411.19±2.226.78±1.52∗4.70±1.0518.84±1.74∗∗16.48±2.3721.83±3.25∗∗1144.36±273.46∗ 低剂量组0.8111.87±2.696.39±0.94∗4.38±0.6219.25±2.47∗∗15.63±0.9524.12±3.97∗∗1065.29±236.32∗∗冷浸高剂量组3.2411.01±1.38∗6.41±1.02∗4.55±0.6619.91±4.0318.30±5.9223.03±3.59∗∗811.53±350.40∗∗ 低剂量组0.8110.80±2.136.51±0,95∗4.54±0.6620.43±3.50∗18.31±3.1522.87±2.36∗∗1072.64±334.38∗∗粉碎高剂量组3.2412.06±1.576.58±1.21∗4.71±0.6017.53±1.30∗16.46±3.2024.31±3.71∗∗1241.74±239.56∗ 低剂量组0.8111.84±1.826.97±1.48∗4.79±1.0517.91±4.3615.84±3.1624.71±2.74∗∗1210.41±345.56∗

与正常对照组比较：##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

表3 金边土鳖对热毒血瘀模型大鼠血流变及凝血功能的影响

组别剂量/(g·kg-1)全血比黏度/(mPa·s)低切[10]中切[60]高切[150]凝血4项APTT/sPT/sTT/sFIB/(g·L-1)正常对照组-8.80±1.845.51±0.524.62±0.4836.66±4.6727.98±7.1830.73±6.60657.62±227.58模型组-12.56±2.91##7.42±1.28##5.14±0.9717.98±3.11##16.62±2.04##18.48±2.31#1341.94±251.09##阿司匹林组0.0048.61±2.55∗5.08±1.06∗∗4.23±0.8528.15±5.04∗21.78±9.0030.47±9.28768.01±199.38∗∗匀浆高剂量组3.248.83±2.34∗5.09±1.08∗∗4.32±0.7827.06±4.21∗17.44±2.6930.03±7.21∗824.24±162.82∗∗ 低剂量组0.819.35±2.37∗5.46±0.72∗∗4.58±0.5925.76±3.38∗17.51±5.0628.30±6.72879.72±215.73∗∗水煮高剂量组3.249.25±2.08∗5.32±0.94∗∗4.48±0.7426.49±5.33∗17.48±4.0528.45±3.38∗∗793.69±211.52∗∗ 低剂量组0.819.98±2.63∗5.95±1.18∗∗4.85±0.8226.30±9.2319.16±6.5825.20±2.94∗∗860.10±267.34∗∗冷浸高剂量组3.249.01±1.95∗5.08±0.75∗∗4.28±0.5935.14±8.64∗∗18.16±3.3426.05±4.50∗586.43±303.42∗∗ 低剂量组0.819.24±1.61∗5.29±0.74∗∗4.48±0.5430.79±8.52∗19.36±5.2826.12±2.93∗∗845.83±304.42∗∗粉碎高剂量组3.249.74±1.78∗5.80±1.16∗∗4.82±0.8428.95±5.28∗∗20.18±4.8425.02±4.50950.04±282.18∗∗ 低剂量组0.8110.02±1.73∗5.89±0.91∗∗4.87±0.6724.46±3.78∗18.30±5.2529.94±1.93∗∗991.97±200.20∗∗

与正常对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

上述实验结果表明，金边土鳖4种不同制法的样品对正常大鼠、急性寒凝血瘀模型大鼠、热毒血瘀模型大鼠都具有明显的改善血液流变性的作用，其作用主要与延长APTT、TT和降低FIB含量等有关。金边土鳖4种不同提取法样品之间比较，彼此间均无显著性差异，均可作为临床应用方式。综合考虑4种金边土鳖样品作用程度，匀浆样品、冷浸样品、粉碎样品作用稍好些，水煮样品作用稍差些；从综合考虑制剂合理性、便利性来看，冷浸工艺耗时过长，粉碎工艺体积过大，水煮工艺作用稍弱，匀浆工艺更适合金边土鳖中药制剂的制备。

本文仅对金边土鳖开展了初步的工艺筛选和药效作用探索研究，为金边土鳖中药制剂开发和合理应用提供了初步参考依据，下一步将开展金边土鳖活血化瘀有效成分的分离及其相关作用机制研究。