雷帕霉素对特发性肺间质纤维化小鼠的治疗作用及其机制

穆清爽，张继云，古力鲜·马合木提，卢雪玲

(新疆医科大学第二附属医院，乌鲁木齐830063)

特发性肺间质纤维化(IPF)是一种发生于肺间质、累及肺泡上皮和肺血管的肺部炎症性疾病，常见于中老年人，临床表现为肺限制性通气或换气功能障碍，可进一步诱发呼吸衰竭。IPF患者的生存时间仅为3～5年，临床5年生存率不足50%[1]。既往研究认为，IPF发病与肺间质纤维母细胞增生、肌成纤维细胞分化和细胞外基质(ECM)沉积有关[2,3]，而mTOR信号通路介导的细胞异常增殖和下游相关p70S6、4EBP1蛋白异常激活被证实与上述病理变化有关[4]。雷帕霉素(RAPA)是一种mTOR信号通路抑制剂，临床常用于器官移植后的免疫抑制治疗，关于其抗纤维化作用目前报道不多。2018年10月～2019年6月，本研究观察了RAPA对IPF小鼠的治疗作用及其对mTOR信号通路的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 45只BALB/c雄性小鼠，6～8月龄，体质量(21.0±2.0)g，购于新疆医科大学实验动物中心。注射用盐酸博来霉素溶液(15 mg/支)购于日本化药株式会社，RAPA(5 mg/支)购于江苏碧云天生物技术研究所；羟脯氨酸(HYP)ELISA试剂盒购于美国MyBioSource公司，蛋白磷酸酶抑制剂(PMSF)、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购于上海天能生物科技有限公司，TRIzol试剂、反转录及SYBR Green试剂盒均购于日本TaKaRa公司，抗体纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1，ab82218)、转化生长因子β1(TGF-β1，ab64715)、mTOR(ab2732)、Ⅱ型微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ，ab48394)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt，ab38449)、磷酸化S6核糖体蛋白(p-S6，109393)、结缔组织生长因子(CTGF，ab6992)以及HRP标记的多聚抗鼠IgG(ab6728)均购于美国Abcam公司。

1.2 建模与分组处理 45只BALB/c雄性小鼠适应性喂养1周，随机分为模型组、治疗组及对照组，每组15只。模型组、治疗组参照文献[5]方法建立IPF模型，即采用异氟烷进行麻醉，仰卧位固定后纵向切皮分离气管，向气管内滴注0.2 mL博来霉素(4 mg/L)；对照组向气管内滴注等量生理盐水。各组滴注完成后迅速直立旋转小鼠使药物分布均匀，缝合皮肤并进行消毒。治疗组按照体质量给予2 mg/kg RAPA腹腔注射，1次/d，连续15 d；模型组与对照组给予等量生理盐水腹腔注射。各组给药21 d后处死，立即分离肺脏组织，取部分新鲜组织立即用于制备石蜡切片及HYP含量测定，其余组织液氮保存。

1.3 肺组织病理观察 ①HE染色：取各组肺组织石蜡切片，常规进行HE染色，PBS冲洗，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。于200倍光学显微镜下观察肺泡出血程度、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润程度、肺泡壁厚度及是否形成透明膜等4个方面，对各组肺组织病理改变及炎症情况进行评分，分数越高表示小鼠病理变化越严重、炎症浸润越明显。②Masson染色：取各组肺组织石蜡切片，梯度水化，先后用Regaud苏木精和Masson丽春红酸性染液染色5 min；PBS冲洗后吸干水分，2%冰醋酸浸润洗涤1次，1%磷钼酸水溶液浸润3 min;苯胺蓝复染5 min，行Masson染色。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。于200倍光学显微镜下观察肺组织纤维化程度，Masson染色可将胶原纤维染成蓝色、肌纤维染成红色；参照文献[14]方法，每个样本取5个视野进行纤维化评分，取平均值。

1.4 肺组织HYP含量检测 采用ELISA法。各组取10 mg新鲜肺组织，干燥后搅碎并充分混合，根据碱水解法采用110 ℃、6 mol/L HCl溶液悬浮水解组织样品，加入等量6 mol/L NaOH溶液高压碱式消化16 h。参照ELISA检测试剂盒加入二甲氨基苯甲醛与吡咯环反应，测定生成的红色化合物在558 nm波长处的光密度值，以此计算肺组织HYP含量。

1.5 肺组织TGF-β1、PAI-1蛋白表达检测 采用免疫组化法。取各组肺组织石蜡切片，脱蜡后经常规梯度水化及抗原修复，采用30% H2O2溶液室温孵育30 min，5% BSA室温封闭1 h。分别加入TGF-β1和PAI-1一抗(1∶500)，4 ℃孵育8 h或至过夜；PBS冲洗3次，滴加HRP标记的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。PBS冲洗3次，加入DAB显色液室温显色5 min后冲净染色液，二甲苯透明，中性树脂封片。于200倍光学显微镜下观察，TGF-β1、PAI-1阳性细胞呈棕褐色深染，记录同一视野下阳性染色细胞数及总细胞数，计算TGF-β1、PAI-1阳性表达率。

1.6 肺组织胶原蛋白1(Collagen1)、Collagen3及CTGF mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组液氮保存的肺组织，充分研磨成粉末后加入TRIzol试剂，提取总RNA；微量核酸定量仪定量检测各样本RNA浓度及纯度合格后，参照反转录试剂盒逆转录RNA合成cDNA。参照SYBR Green试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相对表达量。

1.7 肺组织mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组液氮冻存的肺组织50 mg，加入5倍体积预冷的RIPA裂解液及1%的PMSF，组织匀浆,取上清用于BCA蛋白定量。调节样品浓度一致，加入等体积SDS上样缓冲液，100 ℃变性蛋白样品5 min；各样品取30 g蛋白加入12% SDS-PAGE凝胶上样孔，120 V恒压电泳90 min；转移蛋白条带至活化后的PVDF膜，固定转膜夹，0.2 A恒流转膜75 min。采用5% BSA室温封闭后行常规抗体孵育，凝胶成像仪曝光成像，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH为内参蛋白，以目的条带与内参条带灰度值的比值计算各蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组肺组织病理情况比较 ①HE染色结果：对照组肺泡结构清晰，未见异常病变；模型组肺泡腔消失，组织间隙可见大量炎症细胞浸润，成纤维细胞增多；治疗组组织病变较模型组减轻，肺泡腔形态基本恢复，肺泡内炎症浸润减轻；模型组、治疗组和对照组炎症评分分别为(2.51±0.40)、(1.61±0.36)、(1.15±0.27)分，组间两两比较P均<0.05。②Masson染色结果：对照组无明显蓝染，模型组可见清晰的蓝染胶原纤维积聚并伴随肺泡腔皱缩，治疗组气道周围少许索条状蓝染；模型组、治疗组和对照组纤维化评分分别为(3.08±0.54)、(2.31±0.33)、(1.26±0.31)分，组间两两比较P均<0.05。

2.2 各组肺组织HYP含量及TGF-β1、PAI-1蛋白阳性表达率比较 见表1。

2.3 各组肺组织Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相对表达量比较 见表2。

表1 各组肺组织HYP含量及TGF-β1、PAI-1蛋白阳性表达率比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与治疗组比较，#P<0.05。

表2 各组肺组织Collagen1、Collagen3、CTGF mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与治疗组比较，#P<0.05。

2.4 各组肺组织mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白相对表达量比较 见表3。

表3 各组肺组织mTOR、LC3-Ⅱ、p-S6、p-Akt蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与治疗组比较，#P<0.05。

3 讨论

mTOR属于磷酸肌醇激酶相关蛋白激酶家族，是一种广泛存在于人体和哺乳动物中的不典型丝/苏氨酸蛋白激酶[6]，以mTOR complex 1(mTORC1)和mTOR complex 2(mTORC2)复合物形式存在，而在与RAPA相关mTOR信号通路的研究中发现,只有mTORC1对RAPA刺激敏感[7,8]。有研究表明，RAPA可分别通过介导IGF/PI3K/Akt/mTOR、TSC1-Tsc2/Rheb/mTOR或AMPK/TSC/mTOR信号通路及其下游蛋白磷酸化水平，参与多种疾病发生过程中的蛋白质合成、细胞自噬或线粒体代谢等生物学过程[9,10]。但是，关于RAPA对IPF的治疗作用及其机制相关研究较少。

本研究首先通过组织切片染色观察各组炎症及纤维化等病理变化，结果可见模型组纤维化程度明显，其炎症及纤维化评分较对照组显著升高，证实IPF小鼠模型建造成功；治疗组给予RAPA连续治疗15 d后，其肺组织在组织结构完整性、肺泡间质炎性细胞浸润及组织胶原堆积等方面均存在改善，说明RAPA对博来霉素诱导的IPF小鼠具有一定治疗作用。Masson染色结果表明，治疗组较模型组肺组织胶原纤维沉积明显减少，纤维化评分降低。HYP作为机体胶原蛋白的主要成分之一，可作为衡量不同组织间胶原蛋白沉积的重要指标。肺组织胶原蛋白沉积及纤维结缔组织生成是IPF发生、发展的重要标志。本研究结果显示，治疗组肺组织HYP含量及Collagen 1、Collagen 3、CTGF mRNA表达均明显低于模型组，提示RAPA能够通过减少IPF小鼠肺组织胶原蛋白沉积和结缔组织生成而逆转IPF进程。

以往研究显示，CTGF mRNA转录受上游TGF-β1调控，TGF-β1可结合CTGF启动子区顺式结合元件,招募Smad结合元件共同诱导CTGF表达，同时TGF-β1可参与以胶原为主的ECM生成[11～13]。因此，TGF-β1与CTGF可共同诱导IPF的发生。TGF-β1、PAI-1表达与肺纤维化程度呈正相关，并且二者协同参与调控纤维蛋白溶解系统及体内成纤维细胞的表型转化[12]。PAI-1参与胶原重塑依赖性纤溶酶/基质金属蛋白酶10(MMP-10)/MMP-1轴,或体内microRNA表达调控相关Collagen1/3的合成[13]。本研究结果显示，模型组、治疗组和对照组TGF-β1、PAI-1阳性表达率均依次降低；说明RAPA可能通过抑制TGF-β1、PAI-1表达,调控下游Collagen1、Collagen3、CTGF表达，进而发挥促进纤溶酶原激活、抑制成纤维细胞过度生长及体内ECM沉积的作用。

在原代肺成纤维细胞纤维化模型中，TGF-β1可促进mTORC1活化和Collagen3、纤维黏连蛋白(FN)表达[14]，而mTOR的异常表达可间接反映肺纤维化进程，因此本研究通过检测mTOR及相关蛋白表达变化以验证RAPA对IPF小鼠的治疗作用。结果表明，模型组肺组织mTOR与p-S6蛋白表达水平较对照组显著增加，而治疗组二者表达水平较模型组显著降低，但仍与对照组存在显著差异。有研究报道，RAPA能够通过调控相关细胞因子表达而激活组织及细胞自噬活性，在这类级联反应中，各类细胞因子可通过激活PI3K而促进下游Akt的磷酸化，进而使得mTOR受到Tsc1/Tsc2的激活而活化[15]。LC3-Ⅱ介导的自噬活性下降可促进α-平滑肌肌动蛋白和FN表达，进而加剧ECM沉积，促进IPF进程[16]。本研究结果显示，治疗组肺组织p-Akt、LC3-Ⅱ蛋白表达水平较模型组显著升高，提示RAPA可逆转博来霉素诱导的小鼠肺组织自噬缺陷。综合上述mTOR表达结果，表明RAPA可靶向抑制mTOR信号通路，从而发挥对PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白因子的表达调控作用，减轻IPF小鼠的炎症及纤维化程度。

综上所述，RAPA可减轻IPF小鼠的炎症及纤维化程度，其机制可能与抑制TGF-β1及mTOR表达进而调控PI3K/Akt/mTOR信号通路级联反应有关。