过表达FOXC1对人非小细胞肺癌H1299细胞生物学行为的影响及其机制

韩乐，赵征，宋养荣，雷宝霞，陈文娟

(陕西省肿瘤医院，西安710061)

肺癌是临床上发病率和病死率最高的恶性肿瘤[1]，非小细胞肺癌是其主要类型，约占85%[2]。尽管随着放化疗和靶向治疗的不断完善以及免疫检测点抑制剂的应用，肺癌患者的预后得到很大改善，但原发耐药和继发耐药均严重影响患者预后，Ⅳ期患者5年生存率仅为10%[3]。叉头框转录因子C1(FOXC1)是FOX蛋白家族成员之一，在多种肿瘤发生过程中发挥致癌基因作用[4]，并与肝癌、乳腺癌细胞的侵袭及转移密切相关[5,6]。2018年3～12月，本研究上调人非小细胞肺癌H1299细胞中FOXC1的表达，观察其对细胞生物学行为的影响，并对其机制进行初步探索。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人肺腺癌H1299细胞取自株陕西省肿瘤医院实验室。主要试剂：RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司；FOXC1抗体和基质金属蛋白酶2(MMP-2)试剂盒购自美国Abcam公司，鼠抗人β-actin抗体购自美国Sigma公司，二抗购自中杉金桥生物技术有限公司和美国GeneTex公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；FOXC1目的基因质粒、空载体质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。

1.2 细胞分组处理 将液氮中保存的H1299细胞进行常规复苏，加入含RPMI1640 +10%胎牛血清的完全培养基进行常规培养。取对数生长期的H1299细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为4×105/mL，每孔2 mL细胞悬液接种于6孔板，常规培养。待细胞融合达40%～80%且细胞状态良好时，更换为无血清培养基，随机分为观察组和对照组。观察组按照Attractene Transfection Reagent说明书在EP管中配置转染复合物，包含97.6 μL TE buffer、2.4 μL FOXC1目的基因质粒、4.5 μL Attractene Reagent，混匀后室温放置15 min，加入6孔板中。对照组采用同样的方法转染空载体质粒。两组转染48 h扩大培养，进行后续实验。

1.3 FOXC1表达检测 ①FOXC1 mRNA表达：采用实时荧光定量PCR法。收集两组转染48 h的细胞，加入裂解液提取总RNA，测定浓度和纯度合格后，反转录合成cDNA，进行荧光定量PCR检测。FOXC1上游引物5′-CGCCACAACCTCTCGCTCAAC-3′，下游引物5′-TGTCCTTCTCCTTGTCCTTCA-3′，引物长度21 bp；内参β-actin上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，引物长度20 bp；采用2-ΔΔCT法计算FOXC1 mRNA相对表达量。②FOXC1蛋白表达：采用Western blotting法。收集两组转染48 h的细胞，加入蛋白裂解液，冰上充分裂解约30 min，提取总蛋白，进行蛋白定量并制备蛋白样品。SDS-PAGE电泳，湿转法转膜，5%BSA摇床室温封闭1 h；1×TBST洗涤3次，每次15 min。加入DKK1(1∶2 000)和内参β-actin(1∶8 000)一抗，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次15 min；加入二抗(1∶2 000)室温杂交1 h，1×TBST洗涤3次，每次15 min；ECL显影、曝光。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值计算FOXC1蛋白相对表达量。

1.4 细胞增殖能力观察 采用MTT法。收集两组转染48 h的细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为1.5×104/mL，每孔200 μL细胞悬液接种于96孔板，设置5个复孔，共8块孔板。每天固定时间拿出1块孔板，加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL)培养4 h，弃掉孔中液体；加入DMSO 150 μL，酶标仪上测定492 nm波长处的光密度(OD)值，连续检测8 d。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞克隆形成能力观察 采用平板克隆实验。收集两组转染48 h的细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为2×103/mL，每孔100 μL细胞悬液接种于6孔板，补充细胞悬液至2 mL。混匀后常规培养，当肉眼可见克隆形成时终止培养，PBS洗涤3次；甲醇固定15 min，结晶紫染液染色20 min，自来水冲洗，空气干燥。计数可见克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞侵袭能力观察 采用Transwell细胞侵袭实验。收集两组转染48 h的细胞，无血清培养基重悬，调整细胞密度为5×104/mL。Matrigel基质胶包被Transwell小室基底膜，室温风干。取200 μL细胞悬液加入含8 μm孔径膜的Transwell上室，下室中加入500 μL完全培养基，常规培养24 h。拿出小室，PBS冲洗，干净棉签擦去微孔膜内层细胞；甲醇固定15 min，结晶紫染色20 min，冲洗染液，室温风干。随机选取10个视野，计数穿过基底膜的细胞数，取平均值。实验重复3次，取平均值。

1.7 细胞MMP-2蛋白表达检测 收集两组转染48 h的细胞，参照1.3采用Western blotting法检测MMP-2蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞FOXC1 mRNA及蛋白表达比较 观察组细胞FOXC1 mRNA及蛋白相对表达量分别为0.950±0.020、1.540±0.020，对照组分别为0.010±0.001、0.620±0.030,两组比较P均<0.05。

图1 两组细胞FOXC1蛋白表达情况(Western blotting法)

2.2 两组细胞增殖能力比较 两组培养1～4 d细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，观察组培养5～8 d细胞增殖能力均高于对照组(P均<0.05)。见图2。

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

图2 两组培养1～8 d细胞增殖曲线(MTT法)

2.3 两组细胞克隆形成能力比较 观察组细胞克隆形成率为0.24%±0.01%，对照组为0.13%±0.01%，两组比较P<0.05。见图3。

图3 两组细胞克隆形成情况

2.4 两组细胞侵袭能力比较 观察组穿过基底膜的细胞数为(320.67±3.06)个，对照组为(129.33±6.03)个，两组比较P<0.05。

2.5 两组细胞MMP-2蛋白表达比较 观察组细胞MMP-2蛋白相对表达量为2.42±0.03,对照组为1.25±0.59，两组比较P<0.05。见图4。

图4 两组细胞MMP-2蛋白表达情况(Western blotting法)

3 讨论

近年来，人们越来越重视转录因子在肿瘤发生、发展过程中的作用，转录因子可以改变多种癌基因或抑癌基因表达，有望成为临床干预肿瘤的治疗靶点[7]。FOX蛋白家族是一类重要的转录因子家族，其主要特征是具有翼状螺旋的DNA结合域，在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等生物学过程中均发挥重要作用[8,9]。FOXC1是FOX家族成员之一，定位于人染色体6p25上，其编码的FOXC1蛋白由553个氨基酸构成[10]。FOXC1最初被发现在胚胎神经系统发育中具有关键作用，其基因突变已被普遍认为是Axenfeld-Rieger综合征发病的主要原因[11,12]。

FOXC1已被证实在肝癌、乳腺癌、白血病等多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，并与细胞迁移及侵袭相关。在乳腺癌细胞中，上调FOXC1表达可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而下调FOXC1表达则产生相反作用，其机制可能与FOXC1诱导MMP-7表达有关[13,14]。在肝癌细胞中，过表达FOXC1可以引起初级肝癌细胞发生上皮间质转化，导致肝癌细胞侵袭及转移能力增强，而下调FOXC1表达则可减弱上述过程，且过表达FOXC1可以上调锌指转录因子Snai1表达，但会下调钙黏附蛋白E表达[15]。研究表明，胃癌组织中FOXC1表达明显高于癌旁组织，且FOXC1表达与组织分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及浸润深度有关,FOXC1高表达提示患者预后不良[16]。FOXC1可显著增加食管鳞癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力[17]。研究显示，FOXC1低表达的非小细胞肺癌患者生存时间长于FOXC1高表达者[18]。本研究结果显示，观察组细胞FOXC1 mRNA及蛋白相对表达量均明显高于对照组，说明观察组成功转染FOXC1目的基因质粒并过表达FOXC1；本研究观察组培养5～8 d细胞增殖能力、克隆形成率、穿过基底膜的细胞数均明显高于对照组，说明过表达FOXC1可促进H1299细胞的增殖及侵袭能力。

MMP-2属于基质金属蛋白酶家族中成员中的明胶酶亚群，编码基因位于人染色体16q21。MMP-2是一种明胶酶，可通过降解基底膜的重要组成成分Ⅳ型胶原而促进肿瘤转移[19]。在肺癌组织中，MMP-2表达与肺癌转移倾向具有正相关性，下调MMP-2表达可以显著抑制肺癌转移[20]。在肝细胞癌细胞中下调FOXC1表达，可以同时导致MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9表达下调，且会减弱肝细胞癌细胞的迁移及侵袭能力[21]。本研究结果显示，观察组MMP-2蛋白相对表达量明显高于对照组，提示过表达的FOXC1可能通过上调MMP-2表达而影响H1299细胞的生物学行为。

综上所述，过表达的FOXC1可能通过上调MMP-2表达而促进H1299细胞增殖及侵袭，为后续深入研究FOXC1在非小细胞肺癌中的作用机制奠定基础。