环状RNA-1565对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响及其机制

时浩清，訾晓渊，张春雷，杨琦，孙颖浩

(海军军医大学附属长海医院，上海200433)

前列腺癌在男性癌症发病率中占第3位，病死率占第6位[1,2]，其发生、发展及转移的相关机制尚未明了。环状RNA(circRNA)是一类由线性RNA前体的5′端和3′端共价相连形成的、具有闭合环状结构特点的非编码RNA[3]，在基因的转录后调控中发挥重要作用。目前大部分circRNA包含若干个miRNA结合位点，具有miRNA海绵的功能，是一种新型的竞争性内源RNA。也有研究显示，circRNA可与U1 snRNP、RNA聚合酶Ⅱ等蛋白相互作用，参与调控亲本基因的表达[4,5]。本课题组前期实验结果显示，circRNA-1565在前列腺癌PC-3细胞中的表达显著升高。2017年5月～2018年5月，本研究观察了circRNA-1565对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响，并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：前列腺癌PC-3细胞、人肾上皮293T细胞均购自美国ATCC细胞库，并培养于海军军医大学附属长海医院泌尿外科实验室。主要试剂：FBS、培养液均购自美国Gibco公司，siRNA分子由上海吉玛公司设计合成，Mir-X miRNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，RNA酶购自美国Invitrogen公司，Lipofectamine2000®购自美国Thermo Fisher公司，小鼠抗人磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、蜗牛家族转录抑制子1(SNAIL1)、β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体均购自美国CST公司。

1.2 circRNA-1565对PC-3细胞生物学行为影响的观察

1.2.1 circRNA-1565小干扰RNA(siRNA)筛选 采用实时荧光定量PCR法。PC-3细胞采用含10%FBS、1%青-链霉素的F12培养液，使用25 cm2细胞培养瓶，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据细胞生长状况,2～3 d更换1次培养基。设计两条不同的siRNA(si445、si446)，待PC-3细胞融合至约90%时，分别将其转染进PC-3细胞。转染48 h后进行细胞总RNA抽提，紫外分光光度计检测其浓度及纯度合格，反转录后使用Step One Plus实时定量PCR仪进行PCR反应。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算干扰效率。结果显示，si445与si446的干扰效率均在80%以上，均符合实验要求，本研究选择si445进行后续实验。

1.2.2 细胞分组处理 将PC-3细胞分为观察组和对照组，分别转染si445和阴性对照siRNA，转染24 h。

1.2.3 细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。待PC-3细胞融合至50%～80%时，消化细胞后制成单细胞悬液，密度为1×105/mL。取100 μL细胞悬液接种于96孔板。参照1.2.2进行细胞分组处理，转染48 h。每孔加入10 mg/mL CCK-8溶液10 μL、新鲜培养液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h。采用酶标仪检测450 nm波长处的光密度值(OD450)，连续检测5 d。

1.2.4 细胞克隆形成能力观察 采用克隆形成实验。取转染24 h的两组细胞，消化细胞后制成单细胞悬液。取细胞悬液接种于6孔板，调整细胞密度为1×102/孔，培养箱中培养7～14 d，每隔3 d进行换液并观察细胞状态，直到绝大多数细胞出现大于50的克隆数。吸弃培养皿内溶液，使用甲醛固定细胞30～60 min。吸去固定液，PBS冲洗2次，加入Giemsa染液500 μL进行染色，计数两组克隆形成个数。

1.2.5 细胞凋亡能力观察 采用流式细胞术。取转染24 h的两组细胞，胰酶消化细胞后重悬，取100 μL单细胞悬液，加入5 μL AV-FITC，室温避光10 min。每管加100 μL的上样缓冲液及5 μL PI，轻轻混匀细胞。上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 细胞迁移能力观察 采用细胞划痕实验。待PC-3细胞融合至80%～90%时接种于6孔板，参照1.2.2进行细胞分组处理，转染24 h。用无菌10 μL枪头垂直培养器底部匀力划线，更换含有1%血清的新鲜培养液，37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。培养0、12 h于固定位置取样，计算细胞移动距离。

1.2.7 细胞侵袭能力观察 采用Transwell小室实验。待PC-3细胞融合至50%～80%时，消化细胞后制成单细胞悬液，按照1×105/mL接种于24孔板。参照1.2.2进行细胞分组处理，转染24 h。用微量移液管将200 μL单细胞悬液加入直径为8 μm的24孔板Transwell上室中，下室加入500 μL含FBS的培养基，放入恒温恒湿培养箱中培养24 h。轻轻拂去上室中的细胞，0.1%结晶紫溶液进行染色，计数进入下室的细胞个数。

1.3 与circRNA-1565结合的miRNA筛选 采用免疫共沉淀实验。将生物素标记的探针和非特异性空白对照探针按200 mmol/L转染293T细胞，转染24 h后收集细胞。甲醛固定，加入1 mL裂解液，刮取细胞并静置10 min。超声处理样品，10 000 r/min离心10 min，上清转移至2 mL离心管中。将带链霉亲和素标记的磁珠M-280充分混匀，分装至1.5 mL EP管中，每管100 μL，用RNase-free的BSA和酵母tRNA进行包被。将所获得上清与预处理的磁珠混合，加入200 μL裂解液进行重悬，放置2 h进行解交联。结果显示，circRNA-1565的探针能够富集miRNA 87条(fold>2)，其中显著上调的有28条(fold>10)。结合TargetScan[6,7]和Miranda[8,9]生物信息学数据库的注释，选择miR-21和miR-153进行后续研究。

1.4 circRNA-1565对miR-21和miR-153的调控作用观察 采用双荧光素酶报告基因实验。将circRNA-1565的miRNA结合位点序列克隆到报告基因质粒的R-Luc 3′UTR区，构建荧光素酶报告基因质粒。将能够表达miR-21和miR-153的前体序列分别克隆到过表达质粒pEX-3中，构建pEX-miR-21过表达质粒、pEX-miR-153过表达质粒。利用Lipofectamine2000®将pEX-miR-21过表达质粒、pEX-miR-153过表达质粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153过表达质粒及阴性对照质粒pEX-NC分别与荧光素酶报告基因质粒共同转染293T细胞，每组6个复孔。转染48 h后裂解细胞，加入F-Luc底物检测荧光强度，再加入R-Luc底物检测荧光强度，以后者与前者荧光强度的比值计算报告基因活性。

1.5 miR-21、miR-153对circRNA-1565干扰的PC-3细胞侵袭、迁移能力影响的观察 将PC-3细胞分为si445组、si445+miR-21 inhibitor组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组，分别转染si445、si445+miR-21 inhibitor、si445+miR-153 inhibitor及阴性对照siRNA，参照1.2.6和1.2.7的方法分别观察细胞迁移、侵袭能力。

1.6 细胞PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白表达检测 采用Western blotting法。将PC-3细胞随机分为si445组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组，分别转染si445、si445+miR-153 inhibitor、阴性对照siRNA。转染24 h加入细胞裂解液150 μL，进行SDS-PAGE电泳，置入转膜夹，以300 mA恒定电流转膜1.5 h。将PVDF膜取出，标记正面，置入封闭液中，置于平板荡器上，室温封闭2 h。加入PI3K、PTEN、SNAIL1、β-actin一抗(稀释比例分别为1∶750、1∶750、1∶500、1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(稀释比例均为1∶2 000)，室温孵育2 h。DBA显色，采用BioRAD凝胶成像系统进行曝光， Image J软件分析条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值计算PI3K、PTEN、SNAIL1蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组生物学行为相关指标比较 观察组与对照组不同时间点OD450、克隆形成个数、细胞凋亡率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。观察组进入下室的细胞个数、细胞移动距离均低于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组生物学行为相关指标比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 circRNA-1565对miR-21和miR-153的调控作用 转染pEX-miR-21过表达质粒、pEX-miR-153过表达质粒、pEX-miR-21+pEX-miR-153过表达质粒与阴性对照质粒pEX-NC的293T细胞报告基因活性分别为0.43±0.11、0.49±0.10、0.21±0.06、1.00±0.07，转染阴性对照质粒pEX-NC的293T细胞报告基因活性高于转染其他质粒的293T细胞(P均<0.05)。

2.3 si445组、si445+miR-21 inhibitor组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组细胞侵袭、迁移能力比较 si445组、si445+miR-21 inhibitor组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组进入下室的细胞个数分别为(77±7)、(97±6)、(174±8)、(212±8)个，细胞移动距离分别为(1.0±0.1)、(1.4±0.1)、(2.8±0.3)、(3.1±0.2)μm；与阴性对照组比较，其余三组进入下室的细胞个数、细胞移动距离均降低，且si445组、si445+miR-21 inhibitor组降低更明显(P均<0.05)。si445组、si445+miR-21 inhibitor组进入下室的细胞个数、细胞移动距离比较P均>0.05。

2.4 si445组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组细胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表达比较 si445组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组细胞PI3K蛋白相对表达量依次升高(P均<0.05)，三组细胞PTEN和SNAIL1蛋白相对表达量比较P均>0.05。见表2、图1。

表2 三组细胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白相对表达量比较

注：与阴性对照组比较，*P<0.01；与si445+miR-153 inhibitor组比较，#P<0.05。

3 讨论

我国前列腺癌患者发现时多处于晚期，且多存在远处转移[10]。前列腺癌远处转移部位包括骨、肺和肝脏等，其远处转移的机制尚未完全阐明，但可以肯定其转移是多种复杂分子网络调节异常的结果[11]。近年来，RNA-Seq等研究手段日渐成熟，非编码RNA的作用逐渐得到重视，并发现了一种新的内源性非编码RNA类型——circRNA。circRNA是一类具有闭合环状结构特点的非编码RNA[3]，具有稳定性、组织细胞发育的时空特异性以及保守性等生物学特性，在基因调控过程中具有重要作用[12,13]。circRNA并不是细胞中的“剪切副产物”，而是细胞内不可或缺的部分，具有重要的生物学功能。circRNA与多种肿瘤的发生、发展密切相关[14～19]，并有望成为肿瘤的新型生物标志物甚至治疗靶点，但其在前列腺癌中的研究甚少。本课题组在前期研究中对前列腺癌细胞RNA抽提并质检后进行circRNA测序，成功鉴定出差异表达的circRNA共300余条，其中上调表达的有85条；根据PCR检测结果，结合circBase等公共数据库的注释以及既往相关研究，最终选定circRNA-1565作为研究对象，并证实其在转移性前列腺癌细胞系中表达量高，在非转移性前列腺癌细胞系中表达量低，在前列腺正常细胞系中表达量极低。

注：A为阴性对照组，B为si445组，C为si445+miR-153 inhibitor组。

图1三组细胞PI3K、PTEN和SNAIL1蛋白表达情况(Western blotting法)

siRNA是最方便和广泛的一种人工合成下调目的基因表达方式，其作用在mRNA和LncRNA的研究中得到有效验证。但对circRNA而言，由于其空间结构相对复杂，siRNA的效果很难保证。为了避免脱靶效应，circRNA的siRNA必须靶向设计在接头部位，否则就会造成假阳性。因此，本研究设计了两条不同的siRNA(si445、si446)，其干扰效率均在80%以上，均符合实验要求，选择si445进行后续实验。本研究结果显示，观察组细胞移动距离明显短于对照组，进入下室的细胞个数少于对照组，但两组细胞OD450、克隆形成个数及细胞凋亡率比较均无明显差异；这说明circRNA-1565可促进前列腺癌细胞的侵袭与迁移，但不能影响前列腺癌细胞的增殖与凋亡。

本研究双荧光素酶报告基因结果显示，过表达miR-21、miR-153可通过结合circRNA-1565来抑制报告基因荧光素酶活性，说明circRNA-1565可以分别与miR-21和miR-153直接结合，即circRNA-1565可以通过竞争性结合miR-21和miR-153来发挥相应的生物学作用。本研究结果显示，miR-153 inhibitor可以促进circRNA-1565干扰的PC-3细胞侵袭与迁移，而miR-21 inhibitor的效果则不明显；说明miR-153参与了circRNA-1565介导的前列腺癌细胞侵袭与迁移，而miR-21虽然也可被circRNA-1565调控，但并不参与其介导的前列腺癌细胞侵袭与迁移。通过查阅TargetScan和Miranda等生物信息学数据库对miR-153的注释，并结合既往研究证据，选定miR-153有PI3K、PTEN、SNAIL1等几个下游靶点。PI3K目前已知对细胞的增殖、分化、凋亡均有影响，是一种主要的稳态调节因子，通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路可抑制多种细胞再生过程。本研究结果表明，si445组、si445+miR-153 inhibitor组、阴性对照组细胞PI3K蛋白相对表达量依次升高，三组细胞PTEN和SNAIL1蛋白相对表达量比较无统计学差异；这说明circRNA-1565可通过沉默miR-153来调控下游靶蛋白PI3K表达，该调控机制与PTEN、SNAIL1蛋白无关。

综上所述，circRNA-1565可促进前列腺癌PC-3细胞侵袭和迁移，其机制可能与竞争性结合miR-153并沉默其下游靶蛋白PI3K表达有关。