肾茶总黄酮调节肾缺血再灌注损伤大鼠肾小管上皮细胞凋亡的作用和机制*

郭银雪 葛平玉

（贵州中医药大学第一附属医院 贵阳550004）

急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是一种常见的由于外伤、手术、脓毒血症、肾毒性药物等因素引起的获得性并发症，在临床中有较高的发病率和致死率，具有起病急、进展快的特点[1]。手术、外伤、脓毒血症、肾毒性药物等因素引起的肾缺血-再灌注损伤，是AKI发生和发展的一个重要因素[2]。研究表明，过氧化损伤引起肾小管上皮细胞（TECs）过度凋亡是肾缺血-再灌注损伤的重要病理过程；现代药理研究也证明，肾茶黄酮类成分具有良好的清除自由基和抗氧化的作用[3]。我们推测肾茶总黄酮能通过减轻过氧化损伤以减少肾小管上皮细胞凋亡的途径，达到减轻急性肾损伤的作用，本研究针对这一方面进行了观察探讨。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 自贵州医科大学动物实验中心购进的60只清洁级雄性2月龄SD大鼠作为研究对象，体质量在250～300 g之间，自由饮食常规大鼠饲料，大鼠许可证号：SCXK（黔）2016-0001。

1.2 实验用药、试剂和仪器 肾茶地上部分全草，为唇形科植物猫须草 [Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu]的地上部分，从贵州中医药大学第一附属医院中药房购进。肾茶总黄酮（TFC）采用最佳提取工艺提取获得[4]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase,NOS） 和 丙 二 醛（Malonyldialdehyde,MDA）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；TUNEL检测试剂盒（罗氏Roche公司），罗氏全自动生化分析仪，荧光显微镜（日本Olympus公司），MR23i离心机（美国Thermo公司）。

1.3 动物模型建立 制模手术前6 h禁食，麻醉前称重，预先制备10%的水合氯醛，腹腔注射麻醉，剂量按0.4 ml/100 g计算。麻醉后，大鼠取仰卧位固定于手术操作台上，常规腹部手术备皮，碘伏消毒铺无菌敷料，充分暴露手术区域。自腹正中行纵行切口进入腹腔，找到右肾后常规切除；充分游离暴露左肾及左肾动脉，无损伤动脉阻断左肾动脉，左肾颜色由红润变为苍白表示左肾急性缺血。阻断1 h后恢复灌注，左肾颜色重回红润，提示成功恢复灌流。

1.4 分组与给药 60只雄性实验SD大鼠，常规饲料喂养7 d，采用信封法随机分为对照组、模型组、肾茶总黄酮小剂量治疗组和肾茶总黄酮大剂量治疗组，每组15只。模型组及肾茶总黄酮小剂量治疗组和肾茶总黄酮大剂量治疗组均需构建肾缺血再灌注损伤模型。通过人与大鼠按体表面积折算的等效剂量比值计算各组给药剂量。对照组、模型组以0.9%氯化钠溶液灌胃（按1 ml/100 g剂量计算用量），治疗组以肾茶总黄酮溶液灌胃（大剂量组400 mg/kg、小剂量组100 mg/kg），治疗4 d。

1.5 观察指标 （1）血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）检测：采集大鼠尾静脉血5 ml，注入离心管离心10 min，血清低温保存，采用罗氏全自动生化分析仪测定Cr和BUN。（2）SOD活性通过黄嘌呤氧化酶法测定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，NOS活性采用化学比色法测定。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后常规碘伏消毒铺自制手术洞巾；打开腹腔，无菌条件下取出左肾，切取一半左肾，用4℃预冷0.9%氯化钠溶液洗净血液，吸干水分，用眼科剪剪取一半肾组织，称重，按10 ml/g加0.9%氯化钠溶液，使用玻璃匀浆器匀浆，制成10%肾组织匀浆，转速4 000 r/min（r=142 mm），离心 10 min，取上清液置 4℃保存检测。（3）TECs凋亡指数测定[5]：采用DNA断裂的原位末端标记法 [Terminal Dexynucleotidyl Transferase（TdT）-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL]检测TECs凋亡，用10%福尔马林固定剩余的一半左肾，依次进行脱水、透明、石蜡包埋，制成4 μm切片，行TUNEL检测。应用图文分析报告系统随机采集10个不连续不重复高倍镜视野（HPF，40×物镜），记录每个视野TUNEL阳性TECs个数。肾小管上皮细胞凋亡指数（Apoptotic Index,AI）=阳性细胞数/视野所见细胞总数×100%。

1.6 统计学方法 数据处理采用SPSS25.0统计学软件，计量资料以（±s）表示，采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较应用最小极差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验大鼠BUN和Cr水平比较 模型组肌酐、尿素氮水平与对照组比较显著升高（P＜0.05），显示造模成功；肾茶总黄酮大剂量治疗组治疗4 d后与模型组相比较，BUN和Cr明显下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组实验大鼠BUN和Cr水平比较（±s）

表1 各组实验大鼠BUN和Cr水平比较（±s）

注：与模型组相比较，*P＜0.05；与对照组相比较，△P＜0.05。

组别nBUN（mmol/L）Cr（μmol/L）肾茶总黄酮小剂量组肾茶总黄酮大剂量组模型组对照组15 15 15 15 20.13±1.44 15.13±1.44*25.34±2.46△13.84±1.53 76.64±11.21 68.64±11.21*94.76±13.83△55.41±9.83

2.2 各组实验大鼠AI和肾组织内SOD、MDA、NOS含量比较 与模型组相比较，肾茶总黄酮大剂量组AI和肾组织MDA、NOS含量显著降低（P＜0.05），SOD水平显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组实验大鼠AI和肾组织内SOD、MDA、NOS含量比较（±s）

表2 各组实验大鼠AI和肾组织内SOD、MDA、NOS含量比较（±s）

注：与模型组相比较，*P＜0.05；与对照组相比较，△P＜0.05。

组别 n AI（%）SOD（×103U/g）MDA（μmol/g）NOS（×103U/g）肾茶总黄酮小剂量组肾茶总黄酮大剂量组模型组对照组15 15 15 15 7.37±4.29 4.37±4.29*10.39±6.26△3.11±0.84 23.44±4.62 29.84±5.58*19.31±2.90△31.23±5.27 14.55±1.97 11.32±0.91*16.29±3.51△8.34±0.61 12.66±3.37 11.57±2.25*19.46±4.45△9.76±1.58

3 讨论

细胞凋亡是由一定信号刺激引起，在基因调控下进行自主程序化的细胞死亡，这个过程受到多种因素的影响，在正常生理或病理过程中均可发生，是机体维持细胞数量平衡和清除异常细胞的关键机制[6]。在缺血性肾损伤、药物性肾损害、梗阻性肾脏病等各种急性肾损伤的病理过程中，TECs凋亡都发挥着重要的作用。氧化应激是指机体在各种有害刺激下，自由基在体内产生的一种负面作用，表现为活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子产生过多和消除降低，氧化与抗氧化系统失衡，生物膜脂质过氧化，细胞内酶和蛋白变性，DNA损伤，细胞的凋亡或死亡，组织受损[7～8]。本实验结果显示，在急性肾缺血再灌注后，模型组肾组织内NOS显著升高，肾小管上皮细胞凋亡指数明显增加，导致肾功能发生异常。这表明TECs凋亡参与了急性缺血性肾衰竭的发生和进展，其机制与肾组织内自由基介导的氧化损伤有关。

肾茶为唇形科植物猫须草的地上部分，具有利水消肿、利尿化石、养肾保肾、凉血止血等功效，因其悠久的应用历史和确切的治疗功效，被越来越多的学者重视并进行了深入的研究。现阶段，经众多国内外学者深入研究，已有200余种化合物自肾茶中经提取分离得到，其中主要包括多甲基黄酮化合物、橙黄酮、泽兰黄素等20多种黄酮类化合物。这些黄酮类化合物具有良好的抑制、清除自由基及抗氧化作用[9]，被广泛用于治疗急、慢性肾炎或风湿性关节炎等疾病。

本实验表明，经大剂量肾茶总黄酮治疗后，实验大鼠肾组织中SOD活性明显增高，MDA和NOS水平明显降低。总之，肾茶总黄酮能够减轻肾缺血再灌注损伤大鼠的急性肾损伤，这种作用可能与其升高大鼠肾组织内SOD水平、降低MDA和NOS水平、抑制肾小管上皮细胞凋亡有关。