与HCC相关的HBV T3098C突变的功能研究

陈忠信 郝泽坤 孙 一 虞亚菲 岳宗扬 焦凤萍

山东第一医科大学(山东省医学科学院)公共卫生学院，山东 泰安 271016

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的基因突变与原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发生发展密切相关[1]，HBV的基因突变是HCC发生发展的重要病毒学因素，因此，筛选与HCC发生发展相关的HBV突变对HCC患者的诊断和预防有一定的临床用途。

HBV为不完全闭合环状双链DNA，大小为3215 bp，其基因组虽小，但结构十分精巧，包括有4个相互重叠的开放阅读框、4个启动子和2个增强子[2]。HBV- T3098C突变正位于HBV基因组的Promotor II和preS1的重叠区域，并且可以使preS1蛋白的第84位氨基酸发生改变，使异亮氨酸(Ile)变为苏氨酸(Thr)。在本研究中，我们检测23例HCC患者癌组织中T3098C突变的情况，与患者的临床资料进行分析，寻找临床相关性，并采用细胞学实验来检测T3098C突变对HBsAg合成和分泌的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象 HCC患者术后病理检查的残余的癌组织。

1.1.2主要试剂 2×PCR反应试剂盒、FastPfu高保真酶试剂盒、BioLabs的DpnI酶和TaKaRa的PrimeSTAR聚合酶均购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白酶K溶液、DNA提取试剂盒(Axygen)、HBsAg时间分辨荧光检测试剂盒、琼脂糖等购自泰安华鹏试剂公司。

1.2 方法

1.2.1标本采集 23例HCC患者术后病理检查剩余的标本，在-70℃冰箱冷冻保存。

1.2.2DNA提取和滚环扩增HBV cccDNA 按照Axygen DNA试剂盒说明书的操作步骤提取癌组织的DNA，并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；采用PSAD酶消化非共价闭合环状DNA，滚环扩增方法参照文献。

1.2.3PCR扩增HBV cccDNA的preS区并测序 PCR法扩增HBV cccDNA的preS区，扩增引物参见文献[2]。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中目的条带，送公司测序，测序结果采用DNAStar软件进行分析和比对，寻找HBV C基因型T3098C突变位点在23例HCC患者术后的癌组织中的存在情况。

1.2.4T3098C突变对HBsAg的影响 将Huh7和HepG2两种肝癌细胞接种于24孔细胞培养板，采用Lipo 2000转染试剂，将HBV1.2×野生型质粒和HBV1.2×- T3098C突变型质粒转染至Huh7和HepG2细胞中，在转染后的第2、3、4天分别收集细胞和上清，细胞和上清中HBsAg的含量通过时间分辨荧光试剂盒进行检测。

1.2.5统计分析 应用SPSS17.0软件进行统计分析，采用生存分析及Cox回归分析法，取P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCC患者的临床资料与癌组织中T3098C位点的突变情况

在23例HBV相关肝细胞癌患者中，20例男性，3例女性，年龄的中位数是50岁，病理检查的残余组织来自于河南省肿瘤医院住院患者(2009.07—2012.07)，患者的资料及T3098C突变检测情况见表1。

表1 23例HCC患者的临床资料及癌组织中T3098C位点的突变情况

2.2 T3098C突变位点的生存时间分析及Cox回归分析

将HBV突变位点T3098和C3098进行生存时间分析，发现携带T3098的肝癌患者生存时间短于携带C3098的肝癌患者(P<0.05)，见图1，说明HBV- T3098C突变可能是肝癌患者的保护因素。并使用Cox比例风险模型进行多因素分析，结果见表2，表明T3098C突变是HCC患者术后的独立保护因素。

图1 T3098C突变与患者术后生存时间的生存分析

表2 23例HCC患者采用Cox风险模型预测的结果

2.3 T3098C突变对HBsAg的影响

将HBV 1.2×质粒和HBV 1.2×- T3098C突变质粒分别转染至Huh7和HepG2细胞，转染后第2、3、4天收集上清和细胞，时间分辨荧光法检测HBsAg的含量。结果发现T3098C突变型组细胞内的HBsAg的含量低于HBV 1.2×野生型组(F=42.91，P<0.001),差异具有统计学意义；T3098C突变型组上清和细胞内总HBsAg的含量也低于HBV 1.2×野生型组(F=34.25，P<0.001),差异具有统计学意义，见图2，表明T3098C突变可能降低了HBsAg的合成，并可能促进了HBsAg的外泌。

A.Huh7中细胞、上清和总HBsAg含量；B.HepG2中细胞、上清和总HBsAg含量。** 表示P<0.001。图2 HBV- T3098C和野生型质粒转染Huh7和HepG2细胞后检测的HBsAg含量

3 讨 论

HBV病毒基因组小，复制效率极高，同时在复制过程中虽存在逆转录过程，但缺乏相应的校对机制，使HBV基因组极易出现变异[4- 5]。其中HBV的preS/S区是最容易发生突变的。目前有许多与HCC相关的HBV突变研究报道，如preS/S区的C7A、T53C、C105T等突变[6- 8]。

关于preS/S区突变致HCC发生发展的机制有多种学说：(1)GGH的产生：HBsAg在内质网中过度积累可形成玻璃样肝细胞(GGHs)，GGH又分为I型GGH和II型GGH，一般情况下，呈包涵体样聚集在肝细胞的preS1形成I型GGH，聚集在肝细胞的边缘preS2形成II型GGH。目前认为II型GGH与内质网应激有关，通过产生大量的活性氧、引起DNA的氧化损伤等促进HCC的发生和发展[9]；(2)内质网应激依赖的信号转导途径：目前认为有3条信号转导通路与preS2有关，一是mTOR信号途径，preS2变异体通过激活mTOR信号途径影响脂类代谢而导致HCC的发生发展；二是κβ和p38丝裂原活化蛋白激酶途径，通过上调环氧化酶2，促进细胞增殖和细胞周期的进程而与HCC发生发展相关；三是通过激活钙依赖的蛋白酶I- 钙蛋白酶引起细胞中心体过度复制而促进HCC的发生[10- 12]；(3)反式转录激活作用：preS/S区的3′端截短产物可反式激活癌基因c- myc，使c- myc基因表达异常而干扰细胞的增殖和凋亡，从而促进HCC的发生[13]。

本实验中，23例HCC患者的术后癌组织中有9例存在T3098C突变，T3098C突变生存时间分析表明，发生T3098C突变的肝癌患者的生存时间长于未发生突变的肝癌患者，同时通过Cox比例风险模型进行多因素分析发现，T3098C突变是HCC术后的患者独立的保护预后预测因素。细胞学实验检测结果发现，T3098C突变可能抑制HBsAg的合成和促进HBsAg的分泌。因此，我们推测，T3098C突变可能通过降低HBsAg的合成和促进HBsAg分泌而成为HCC患者独立的保护预后预测因素。