Period基因在乳腺癌中的研究进展

郑晓东 综述 马德奎 审校

广东医科大学，广东 湛江 524000

据2018年全球癌症统计数据：女性乳腺癌发病率在恶性肿瘤中排第二(208.9万)，仅次于肺癌(209.4万)，是女性发病率及死亡率最高的恶性肿瘤(62.7万)[1]。近年来，人们结合大量的流行病学资料发现乳腺癌的分子原因与人类昼夜节律失调相关[2]。目前研究表明昼夜节律是由至少14 种核心生物钟基因呈昼夜节律性表达所致，包括PER-1、PER-2、PER-3、Clock、CRY1、CRY2、ARNTL 或BMAL1、TIM、ROR、NPAS2、NR1D1 和NR1D2、CSNK1E，这些基因存在于下丘脑的视交叉上核SCN(suprachiasmatic nucleus)中，在外周组织中也有表达[3]，组成了转录-翻译反馈环路[4]。其中Bmal1/Clock异源二聚体激活Per(1-3)和Cry(1、2)基因，然后Per/Cry复合物在细胞质中积聚后，重新定位到细胞核中，使Clock/Bmal1 反式激活失活下调其自身的表达，从而以24 h 为一个周期的表达形式控制着生物节律[5]。本文就生物节律中的核心基因Period基因与乳腺癌的关系进行综述。

1 Period基因的概述

1.1 Per 基因的发现与结构 KONOPKA 等[6]于1971 年在果蝇的X 染色体中发现了Per (PerO、PerL、PerS)基因，而这3个基因的突变都会对果蝇昼夜节律有极大的影响。随后，在鼠和人中也发现了类似果蝇的Per 基因，并且存在Per1、Per2、Per3 三种基因型，在SCN、脑和外周组织中均有表达，是哺乳动物生命活动中的分子中心节律振荡器和外周节律振荡器的重要元件，它们在表达的部位和时相上存在差异。人类Per1 基因在中枢表达，Per2 基因在中枢和外周组织都有表达，Per3 基因只在胚胎期有表达[7]。Per1 基因位于染色体17p13.1p12 上，编码含1 290 个氨基酸，分子质量为136 KD的蛋白；Per1基因包含一个bHLH-PAS结构域和一个PTD 区域。Per2 基因位于染色体2q37.3 上，基因长度为51 529 bp，mRNA 长6 342 bp，包含了23 个外显子，它的转录和翻译产生含1 246 个氨基酸的Per2 蛋白，后者包含两PAS-A 和PAS-B 两个区域[8]。Per3 基因位于染色体1p36 上，基因长度为60 475 bp，mRNA 长6 203 bp，共有21 个外显子，编码1 201 个氨基酸。在第18 个外显子区域存在4 个或5个串联重复序列(variable number tandem repeat，VNTR)，每个VNTR 编码18 个氨基酸，这被称为Per3基因的多态性[9]。

1.2 Per基因的功能 在哺乳动物的生物节律调节中，Per 基因(至少是Per1 和Per2)起着核心的作用。实验中发现敲除小鼠Per 基因后其日节律异常，但只要Per1、Per2 基因存在便能保持日节律，而Per3基因被破坏的小鼠，其日节律并不会出现紊乱，从而推断Per3 基因可能不是维持日节律环路所必需的[10]。另一方面，因为Per 基因可以下调CyclinD1、C-myc、Wee1 等细胞周期蛋白而导致细胞周期由G1→S 或G2→M的进程受抑制从而调控细胞周期[11]。此外，研究还发现基因损伤因素如放射线、细胞毒性药物等，能诱导生物钟基因Per 表达上调从而促进DNA 损伤修复[12]。而Per3基因中VNTR多态性与一系列睡眠和昼夜节律特征相关，包括时间类型、每日社交和活动节律的稳定性、总睡眠时间和“深度”非快速眼动睡眠的量等有关[9]。正是因为Per基因在控制生物节律、细胞周期和促进损伤修复等方面有关键调节作用，所以当Per基因表达异常时可能在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。

2 昼夜节律与乳腺癌

2.1 昼夜节律与乳腺癌的流行病学关系 目前许多研究已经证实了夜班工作和癌症之间的潜在联系，特别是护理或服务人员昼夜颠倒排班与乳腺癌发病率的研究数据更能体现昼夜节律紊乱与乳腺癌的关系。丹麦的一项病例对照研究中发现轮班工作的服务职业女性患乳腺癌的风险增加，其危险相关(OR=1.5，95%CI=1.2～1.7)[13]。国内研究表明[14]夜间工作与乳腺癌风险增加相关(RR=1.20，95%CI=1.08～1.33)，无论是病例对照研究(RR=1.32，95%CI=1.17～1.50)还是队列研究(RR=1.08，95%CI=0.97～1.21)均显示夜间工作与乳腺癌风险呈正相关。法国学者在2005 至2008年期间开展了一项以人群为基础的大规模病例对照研究，其结果显示首次怀孕就开始上夜班的女性患乳腺癌的几率更高[15]。此外，2017年发表的一项随访超过22 年的前瞻性研究显示，对整个美国连续的局域网环境进行了时变的客观测量，发现生活在室外局域网水平高的地区的妇女侵袭性乳腺癌风险增加了14%[16]。所有这些流行病学研究都有力地表明昼夜节律的紊乱会增加患癌症的风险。

2.2 生物钟基因Per在乳腺癌中的表达情况及特征 不少研究证实了Per基因在各种癌症中出现异常表达的情况，并且在某些肿瘤中Per基因的表达下调往往预示着肿瘤具有更高的恶性程度，从而推测Per基因可能是抑癌基因。包括在非小细胞肺癌(NSCLC)[17]、腹部恶性肿瘤[18]等组织中，对肿瘤组织与邻近正常组织比较时Per 基因均出现低表达的情况。台湾学者CHEN等[19]用免疫组织化学染色方法分析了55例台湾女性乳腺癌患者中的Per 基因(Per1、Per2、Per3)，发现与邻近的非癌细胞相比，乳腺癌细胞中的三种Per 基因有超过95%的表达受到干扰。国内张寅斌等[20]取60例手术切除或活检乳腺浸润性导管癌患者癌组织和癌旁组织，分别用免疫组织化学染色方法检测Per1、Per2基因蛋白表达，与病理和临床结果进行统计学分析。结果显示Per1、Per2 基因在乳腺癌细胞和癌旁组织中阳性表达率有显著差异(P＜0.01)。乳腺癌Per1蛋白表达和ER、PR、c-erbB2 表达、组织分级有显著相关性；而Per2蛋白的表达与c-erbB2、组织分级有显著相关性，证明了Per1、Per2基因表达缺失和乳腺癌发生有关，在乳腺癌发生过程中具有重要作用。LESICKA等[21]利用实时定量PCR技术对107例新诊断乳腺癌患者的肿瘤组织和正常组织进行了Per基因(Per1、Per2、Per3)表达的分析，与非肿瘤标本相比，Per1(P＜0.000 1)、Per2(P=0.037)、Per3 (P=0.001)的mRNA 水平显著降低；在ER/PR阴性的乳腺肿瘤中Per1、Per2基因的表达明显低于ER/PR阳性的乳腺肿瘤。目前关于Per基因在乳腺癌中的表达研究与其在大部分癌症中的表达相比无明显差异，均显示Per基因出现低表达的情况。

3 Period基因抑制乳腺癌的机制

3.1 启动子甲基化 关于Per基因在乳腺癌中出现低表达的机制，Per基因启动子区域的甲基化状态备受关注。SAMULIN等[22]已经证明，在日夜颠倒工作者中的乳腺癌患者生物钟基因的甲基化状态发生了变化，包括与对照组相比Per1基因的启动子区甲基化水平升高。CHEN等[19]的研究首先揭示了Per基因的去调控不是由基因突变引起的，而是由Per1或Per2基因启动子甲基化引起的，且Per1 基因启动子甲基化与c-erbB2 表达密切相关(P=0.017)。KUO 等[23]的研究也证实了Per1、Per2基因在乳腺癌中启动子发生高甲基化的观点，并发现Per1启动子甲基化与≥2+的c-erbB2免疫组化反应相关(P=0.012)，与雌激素受体阳性呈强负相关(P=0.016)。LESICKA等[24]最新的研究发现从乳腺癌患者中分离的基因组DNA中，Per3(19.23%)和Per2(2.38%)的启动子甲基化百分比最高，其次是Per1(1.51%)，且Per因启动子区甲基化水平的升高与乳腺癌的分子亚型、组织学亚型和肿瘤分级之间存在关联。

3.2 抑制增殖 目前的研究发现Per 基因对细胞周期严密的调控作用，正常细胞周期是在Cyclins-CDKs-CKIs 细胞周期分子网络系统的精确调控下按严格的时间顺序沿着G1-S-G2-M时相运转[25]，管理G2/M 进展的Cdc2-cyclin B1 复合物受到CDC25磷酸酶的正调控，而受Wee1 和Myt1 激酶的负调控。GREY 等[26]的研究发现Per1 基因受抑制可以降低CyclinB1、Cdc2和上调Wee1的水平，可能是通过上调抑癌基因p53 途径进行调节的，从而使癌细胞停滞在G1、G2期。Per2基因过表达以后一方面显著下降了正向周期调控蛋白C-myc、Cyclins 的表达，使得肿瘤细胞在G1期阻滞；同时也会直接上调Wee1 的表达或者通过上调p53 抑制CyclinB1 的表达，从而使癌细胞停滞在G2期[27,28]。Per1、Per2 基因通过这种阻滞细胞周期的作用抑制乳腺癌细胞的增殖。

3.3 促进凋亡 另一方面，Per基因的表达失调影响乳腺癌的发生是由于参与基因修复的调节作用。Per1、Per2基因包含在DNA损伤通路中，Per蛋白能够与ATM(ataxia telangiectasia mutated gene)和Chk2激酶的磷酸化及非磷酸化形式结合，参与ATM→Chk2 DNA损伤信号通路，通过激活抑癌基因p53可以诱导细胞短暂停滞在G1期，从而使细胞有时间修复受损的DNA。不能修复的则通过上调c-Myc 抑制p53 诱导的p21Waf1/Cip1的表达来促进细胞凋亡或者由p53直接与BCL-2家族成员促进线粒体的细胞透化作用促进癌细胞凋亡[26,29-31]。也有研究表明用Period3基因可以直接激活Chk2 蛋白损伤修复过程；另外，由于Per1 和Per3蛋白的核定位需要两者的二聚化同时作用，因此Per3 的低表达可能阻止Per1 蛋白的核输入来抑制检查点的激活，在这两个层面参与到了乳腺癌的抑制中来[32]。

4 Period基因与乳腺癌的生物时辰治疗

目前恶性肿瘤的治疗主要以放化疗为主，而无论是化疗还是放疗都不可避免给患者带来巨大的毒副作用。因肿瘤细胞的生长依靠细胞周期转化，也与昼夜节律有关[33]，自HRUSHESKY 等[34]率先运用阿霉素和顺铂对卵巢癌进行特定时间的时辰治疗以来，各项研究对不同系统的肿瘤联合时辰放化疗都获得较好的临床收益[35]。可推测对细胞周期调控起重要调控作用的Per基因在时辰治疗中或将成为巨大的发现。且国内研究发现对乳腺癌行联合时辰化疗与常规化疗比，具有疗效高、副作用低的优点，值得临床推广应用[36]。但肿瘤的时辰治疗仍处于初期，临床治疗效果的获益性与Per基因的时间性表达相关性仍需进一步研究探索。

5 展望

Per基因在生物节律、细胞周期、恶性肿瘤的发生中发挥着重要的生物学作用。虽然不少研究发现Per基因在乳腺癌组织和癌旁非癌组织中的表达有差异并影响着预后，但如何将Per基因的生物学功能更好地用于乳腺癌的临床治疗尚有许多问题需要解决。随着研究数据的不断累积和丰富，期望临床能够阐明Per基因与乳腺癌的联系，将有利于乳腺癌新治疗策略的发展，并为指导时辰治疗、评估疾病预后等提供依据。