嘌呤能离子通道型受体7及其在周围神经再生中的作用

何宛俞，黄积根，邓礼勤，丁林威，张全鹏

1.海南医学院基础医学与生命科学学院16级生物技术本科班，海南 海口 571199；2.海南医学院基础医学与生命科学学院17级生物技术本科班，海南 海口 571199；

3.海南医学院基础医学与生命科学学院18级生物技术本科班，海南 海口 571199；

4.海南医学院基础医学与生命科学学院解剖学教研室，海南 海口 571199；

5.海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南 海口 571199

嘌呤能离子通道型受体7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7R)是嘌呤受体的一个亚型，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)门控的非选择性离子通道[1]，在P2XR家族中，P2X7R在炎症细胞和抗原呈递细胞的激活中起着重要作用[2]。

1 P2X7R的结构和分布

P2X受体家族是由胞外ATP激活的离子化阳离子通道，允许阳离子如Ca2+、K+和Na+通过，ATP-P2X信号能使胞外Ca2+内流，导致神经组织中的离子迁移与细胞死亡[3]。人类P2X7R 定位于染色体12q24，由P2X7基因编码P2X7R，其含有13 个外显子，由595 个氨基酸残基组成，有3 个同源亚基，每个亚基含有两个跨膜结构域环和一个糖基化的胞外环，胞外环上有ATP结合位点，胞内含有一个长链羧基端(C 端)和一个短链氨基端(N 端)，其中C 端为P2X7R 主要的功能结构域[4]。这种受体主要表达于单核细胞、巨噬细胞[5]和哺乳类动物神经节中的卫星胶质细胞[6]。

2 P2X7R的功能

2.1 P2X7R促神经生长和促细胞增殖的作用 正常情况下，胞外ATP的浓度受到胞外ATP酶和ADP酶的严格调控，其浓度一直处于低水平[7]。神经细胞受到损伤后释放ATP，促进周围神经再生轴突定向的生长、促进再生轴突成熟、保护脊髓神经元和预防失神经支配的肌肉萎缩[8]。ATP-P2X7R 可通过MAPK/ERK 胞内信号转导途径促进细胞的增殖[9]。MAPK/ERK 通路通过多种磷酸化级联反应参与调节多种细胞的生长和分化。同时有研究表明，周围神经损伤后，ATP 促进雪旺细胞的增殖，在受损神经形成Büngner带，促进轴突的生长和伸长[10]，干扰P2X7R基因促进巨噬细胞增殖[7]。shRNA抑制P2X7R基因抑制细胞增殖和诱导凋亡，间接提示P2X7R有促进细胞增殖和存活功能[11]。

2.2 P2X7R 与细胞损伤 细胞受到损伤时可引起P2X7R膜的通透性发生改变，如在低浓度的二价阳离子环境下，经过高浓度激动剂的长时间或反复刺激，P2X7R的膜通透性会发生改变，阳离子通道转变为非选择性的膜通道，可通透分子量达900 kDa左右的分子和离子[如：荧光素黄(lucifer yellow)、溴化乙锭等]。分子量较大的有机阳离子可通过这种通道进入细胞，改变了离子通透性，诱导细胞骨架重排，最终导致细胞溶胞死亡[12-13]。神经细胞受损会导致ATP 的浓度增高，P2X7R膜孔形成，表达P2X7R的邻近细胞死亡，最终导致坏死细胞的数量增高[14]。在P2X7R介导下，胶质细胞释放出的ATP作为神经元-胶质细胞通讯中的信号分子，胶质细胞受ATP刺激，其形态发生改变，P2X7R表达增加，在ATP持续刺激作用下可导致胶质细胞的凋亡，从而阻止炎症反应的持续存在[15]。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，活化的Akt会通过磷酸化细胞内蛋白质来介导下游应答，包括细胞的存活、生长、增殖、细胞凋亡等生物学过程[16]。当胶质细胞受到损伤时，释放的ATP作用于胶质细胞上的P2X7R，使P2X7R活化，释放谷氨酸和ATP，调节神经元的兴奋性[17-18]。ATP的释放可使胶质细胞中细胞因子表达增强，胶质细胞间隙连接参与了神经保护过程，特别是谷氨酸毒性引起的损伤和保护神经元免受氧化应激[19]。ATP通过肥大细胞释放组胺、前列腺素，通过免疫细胞产生和释放细胞因子来参与炎症的发展[20]。

2.3 小结 有证据表明，当神经细胞受到损伤后，其分泌的ATP 会作用于胶质细胞膜上的P2X7R，形成ATP-P2X7R信号通路，促进神经细胞轴突的生长和伸长，促进胶质细胞的增殖和生长[6]。同时有文献报道，胶质细胞受到损伤后也会分泌ATP，促使胶质细胞发生形变，P2X7R 的表达升高，最终导致胶质细胞死亡[15]。ATP的释放可以使胶质细胞上的细胞因子的表达升高，可保护神经元免受氧化应激和谷氨酸毒性介导的细胞损伤[19]。因此，P2X7R 在周围神经再生中的功能尚未完全明确。

3 P2X7R 在周围神经再生中具体作用的研究方法

在活体动物模型中，可以通过P2X7R基因敲除来使机体分泌细胞因子和能力下降，缓解炎症反应[21-22]，但敲除P2X7R基因仍能够检测到该蛋白的阳性表达[23]。在研究肿瘤细胞时，可以通过shRNA转染抑制P2X7R基因表达，进而抑制细胞增殖能力并诱导细胞凋亡[11]。在研究正常的在体细胞时，将P2X7R-shRNA 重组质粒转染至靶细胞，抑制P2X7R 蛋白的表达，从而促进细胞生长，提高细胞增殖活性；还可以采用RNA干扰技术构建稳定干扰P2X7R基因，该基因被抑制后，细胞生长和增殖活性明显升高[7]。而P2X7R抑制剂BBG和激动剂2'(3')-O-(4-苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸三乙基铵盐(Bz ATP)也是研究P2X7R功能丢失和功能获取后观察其功能的一种常用方法。P2X7R 抑制剂有Briliant Blue G(BBG)、AZD9056、A438079、CE224 和535[24]、oxidized ATP[25-26]，其中BBG是最常用的抑制剂，P2X7R激动剂有Bz ATP、ATP、2-MeSATP、α,β-meATP[27]，其中，研究P2X7受体功能最常用的激动剂是Bz ATP。

4 P2X7R抑制剂BBG和激动剂Bz ATP

4.1 BBG 的作用机理 P2X7 受体抑制剂BBG可拮抗抑制胶质细胞上的P2X7R发生变构，使ATP不能与其结合，中断了ATP-P2X7R 的信号通路，使神经细胞免受ATP诱发的兴奋性损伤，减少炎性介质的释放，降低了细胞的死亡率[13，28]。P2X7受体活性通过促进细胞的存活和增殖，调节增殖和分化途径，而抑制剂则可能导致分化和轴突的形成，抑制神经元死亡率的增长[3]。这个机制意味着当ATP和P2X7R受体结合时，其他药物就很难与该受体结合，也防止了受体和抑制剂的结合[29]。

4.2 BBG 的使用方法及优缺点 在无菌条件下称取1.7 g BBG，加PBS 溶液溶解后调整浓度至100 mmol/L，于-20℃储存，用时再稀释成100 nmol/L浓度，可用于细胞培养时对细胞进行干预[12]。也可用BBG 腹腔注射，剂量为5 mg/100 g[30]。BBG 具有以下优点：(1)渗透压和pH 值较稳定，染色效果好；(2)不是荧光染料，不会产生光毒性；(3)染色所需要的浓度低；(4)是新型的生物染色剂，无生物毒性[31-33]。在配置BBG 时，微量的BBG 粉末需要用到大量的溶剂来进行稀释，在实验中难以把控其剂量。

4.3 Bz ATP 的作用机理 Bz ATP 是最有效的P2X7受体激动剂，Bz ATP诱导的痛觉过敏仅由P2X7受体激活介导其诱导剂量依赖性的机械超负荷[34]。ATP激活胶质细胞细胞膜上P2X7受体，形成非选择性阳离子通道，这时K+、Na+和Ca2+等离子跨膜性流动具有很强的选择性，在这一环境下P2X7 受体的激活使离子通道扩张，形成可以允许分子量达900 kDa 左右的分子和离子通过的孔道，大分子物质可顺利通过并改变细胞的功能状况，其始动环节是ATP 介导P2X7受体构象发生了改变，形成离子通道[35-36]。

4.4 Bz ATP 的使用方法及优缺点 在无菌条件下，5 mg Bz ATP加入PBS溶液，调整浓度至1 mmol/L，于-20℃储存，用时再稀释成100 µmol/L 浓度[12]。Bz ATP 腹 腔 注 射 的 剂 量 为5 µg[30]。P2X7R 激 动 剂Bz ATP(100 μmol/L)刺激细胞后，在增加细胞内Ca2+水平和迁移的同时，既不影响细胞增殖，也不引起膜孔开放[37]。P2X7受体激动剂效价最好的是Bz ATP，该物质是稳定的ATP类似物，其效价远远大于ATP，其激活人和大鼠P2X7受体的效能是ATP的50倍[38-39]。机体的损伤可引起P2X7R活化，神经细胞释放大量的ATP，作用于卫星胶质细胞上的P2X7R并使其活化。P2X7R活化机制如下：(1)通过谷氨酸转运体的胞吐机制从神经细胞内转运出ATP，神经细胞内的K+和Ca2+的迁移；(2)神经细胞释放ATP，其作用于卫星胶质细胞上的P2X7R并使其活化，促进炎症介质的释放；(3)炎症介质的释放直接或间接使细胞损伤、死亡和凋亡[40-41]。

5 展望

蛋白的功能可以通过其激动剂和抑制剂的干预来达到研究目的，还可以通过基因敲除来消除或减弱该蛋白的表达以及通过转染的方式来增强该蛋白的表达。但是在体动物的模型研究中，发现机体的P2X7R基因并不可以完全的敲除掉，但P2X7R的基因敲除可以减弱ATP-P2X7R 信号通路而引起的炎性反应。卫星胶质细胞和神经细胞的相互作用的机制复杂，目前尚不完全阐明清楚，本文为研究卫星胶质细胞P2X7R在神经再生中的具体功能提供方法学支持。