不同极限pH值牛肉品质差异及机制的研究进展

王 晶，罗 欣,2，朱立贤，李 航，郝剑刚，张一敏,

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095；3.国家肉牛牦牛产业技术体系丰都综合试验站，重庆 408216；4.国家肉牛牦牛产业技术体系乌拉盖综合试验站，内蒙古 乌拉盖 026300）

随着人民生活质量的提高，消费市场对牛肉的需求不断增加，消费者也更加关注肉类的品质。生鲜肉的品质包括颜色、嫩度、保水性、多汁性等。其中，消费者会根据肉色来判定牛肉的新鲜程度，因此肉色是决定消费者购买意愿最重要的指标之一。DFD（dark, firm and dry）牛肉为一种颜色异常的肉，其表面黑、干、硬，也称为黑切牛肉。DFD牛肉的极限pH值（ultimate pH，pHu）较正常肉高，不同的国家采用的标准不尽相同，各国DFD牛肉发生率直接受pHu阈值的影响[1]。在美国通常以pHu＞6.0作为标准，其发生率为3.2%～10.0%[2]；巴西以pHu＞5.8为标准，其发生率为4.53%[3]；我国以pHu＞6.09为DFD牛肉的判定标准。目前DFD牛肉发生率较高，因此明确DFD牛肉的发生机制和食用品质特征，对于控制DFD牛肉的产生及采取合适的DFD牛肉加工处理措施、提高DFD牛肉的利用率、降低相关企业的经济损失具有重要意义。

不同pHu牛肉因pH值的不同，其肉色、嫩度和保水性等食用品质存在显著差异。高pHu牛肉肉色呈现黑紫色，但是具有较高的保水性和较好的嫩度；中间型pHu牛肉肉色与正常肉差异不显著，但是嫩度最差。屠宰后24～48 h牛肉的pH值趋于稳定，在许多研究和工业中将这个时间的pH值用作检测DFD牛肉的基准。pHu在5.8～6.2之间的牛肉，在视觉上无法与正常pHu的牛肉区分，其肉质韧性增加，可能是因为pH值在5.8～6.2之间的蛋白水解活性降低，这个pH值范围超出了钙蛋白酶和溶酶体酶系统的最佳pH值[4]。除此之外，高pHu牛肉为微生物的生长提供了更有利的条件，因此具有较快的腐败速率。

本文从pHu形成的角度，阐述了DFD及中间型pHu牛肉的形成机制，进而从肉色、嫩度、保水性和微生物等方面综述了不同pHu牛肉的品质差异特征（表1）和潜在的品质差异机制，以期为不同pHu牛肉品质的改善提供科研思路和理论指导。

表1 不同pHu牛肉的品质差异概述Table 1 Summary of quality differences among beef with different ultimate pH

1 极限pH值

动物宰后肌肉内因氧气供应中断，糖原分解代谢由有氧代谢变为无氧代谢，生成乳酸；同时ATP分解形成H+，使肌肉pH值迅速下降。在糖原充足的情况下，pH值下降到能够抑制肌糖原无氧酵解过程中的酶活性时，糖原不再继续分解，pH值不再继续下降，此时的pH值称为宰后肌肉的pHu；当糖原含量不充分时，糖原完全消耗时肌肉的pH值为高pHu，因此，pHu与肌肉糖原含量密切相关。有学者研究发现，当牛肉pH＞6.0时，宰前肌肉内的糖原含量已经显示低于66 mmol/kg[11]，也有学者以肌肉内57 mmol/kg的糖原含量作为临界水平[6]。

宰后糖原含量与动物宰前应激有关，卢骁[10]、Hanson[11]等概述了引起动物宰前应激的因素，如果动物在屠宰前已经大量暴露于应激环境中（如恶劣天气、过度运动、缺水或饲料、与不熟悉的动物混合或发情），肌肉中的糖原含量可能会严重减少。虽然肌肉内pH值与糖原含量存在联系，但是宰后糖原水平并不能完全反映黑切现象，Wulf等[12]发现在加拿大牛肉分级中，pH＜6即出现黑切现象，糖原含量在40～50 mmol/kg。

2 肉色

2.1 DFD牛肉的评测

颜色是肉的重要品质特征，是视觉外观和消费者可接受性的重要属性，直接影响消费者购买意愿。影响肉色的因素很多，包括品种、年龄、性别、宰前处理等宰前因素和屠宰工艺、包装方式、贮藏温度等宰后因素。不同动物肌肉中的肌红蛋白含量存在差异，造成肉色的差异；同一动物品种的不同部位肉之间的肉色及肉色稳定性也存在差异，背最长肌的肉色稳定性要明显高于腰大肌。宰前应激会导致肌肉内糖原含量降低，使得pHu偏高，导致DFD牛肉产生。

DFD牛肉主要通过可见光谱内的视觉评估以及触摸时肉表面的干燥和坚固程度来识别。在加拿大，DFD胴体被降级为B4级，给牛肉生产者造成重大经济损失；美国农业部使用D0到E0级来描述胴体成熟度，颜色范围从暗红色到深暗红色判断是否为DFD牛肉；在澳洲一般使用比色卡，并且当比色卡分数不低于3时即视为DFD牛肉。客观的颜色测定已被用作评判DFD牛肉的标准[13]。

2.2 不同pHu值牛肉特征肉色的形成机制

宰后一定时间内，肉色与pH值存在一定的关系，Hughes等[14]研究表明在宰后14～31 h，当pHu分别为5.8、6.0和6.2时，比色卡肉色分数大于3的比例分别为28%、74%和96%，而当pH值为5.4和5.6时的胴体只有1%和5%的肉色分数大于3，这表明不同pHu间的肉色差异很大，肉色形成与pH值密切相关。有学者对宰后正常pHu组（5.40≤pHu≤5.79）、中pHu组（5.80≤pHu≤6.09）和高pHu组（pHu≥6.10）牛肉肉色进行测定，结果表明除了DFD牛肉的L值，3 个pHu组的所有肉色指标随着宰后时间的延长呈现增加的趋势，而且正常pHu组的增加幅度最大，中pHu组次之，高pHu组的牛肉显示出最小程度的肉色变化[15]。

不同pHu之间的牛肉肉色差异明显，正常pHu牛肉表现出较高的亮度、红度和黄度。正常牛肉的肉色初始值大于DFD牛肉，而大多数研究显示中间型pHu（pH 5.8～6.2）牛肉的肉色与正常肉无显著差异。此外，还发现DFD牛肉呈现紫黑色，但其具有较高的肉色稳定性。pH值对牛肉红度的影响可能和宰后线粒体的氧气消耗有关，宰后肌红蛋白与线粒体竞争性耗氧，较高的pH值有利于线粒体的呼吸，因此高pH值条件下肌红蛋白多以脱氧肌红蛋白的形式存在，呈现出较暗的颜色[16]。高pHu牛肉中蛋白质变性程度较小，肌肉中的水分被牢牢束缚住，因而仅有很少的汁液渗出，而此时肌原纤维的收缩程度较小，二者之间的折射率差异也较小，使肌肉处于一种封闭的吸收光而非折射光的状态，导致肉色发黑[17]。在低pHu肌肉中存在更复杂的光散射机制，较低的pH值引起肌纤维碎片收缩允许肌肉内更多的光散射，其涉及到pH值依赖性横向收缩以及更高水平的变性肌浆蛋白。相较于低pHu，在高pHu牛肉中L值要低5.3～7.8 个单位，并且与pHu存在显著负相关，与黑色肌肉相关的高pHu可以减少肌纤维晶格和肌原纤维的收缩，从而导致肌纤维膨胀和表面反射系数降低[18]。正常pH值牛肉的脱氧肌红蛋白含量显著低于DFD牛肉，氧合肌红蛋白含量显著高于DFD牛肉[19]，高pH值下，光散射减少与肉表面的氧合肌红蛋白有关[20]，而低pHu组中出现浅色很可能是由于肌肉中产生酸性环境导致结构蛋白变性[21]。pH值的下降速率与磷酸果糖激酶和乳酸脱氢酶-B的活性呈正相关，而DFD牛肉表现出较高的肉色稳定性与甘油醛-3-磷酸脱氢酶和乳酸脱氢酶-A的浓度较高有关[22-24]。有学者研究表明，DFD牛肉出现黑切现象与肌肉糖酵解蛋白有关，DFD牛肉中肌酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和甘油-3-磷酸脱氢酶（NAD+）的水平低，侧面反映了糖酵解受到抑制，这表明DFD牛肉中的糖酵解能力受损会导致黑切现象的出现[25]。

3 嫩度

3.1 不同pHu牛肉嫩度的差异

嫩度作为肉的主要食用品质之一，能够反映肉的质地，是消费者评判肉质优劣最常用的指标。成熟过程中改善肉嫩度主要通过肌原纤维骨架蛋白的降解和由此引发的肌纤维结构的变化来实现，随着成熟时间的延长，嫩度上升[26]。肌节长度对肉的质构特性有着显著的影响[27]；不同的pH-温度下降速率，其嫩度存在明显差异，有研究表明，宰后的pH值下降速率影响肌肉的嫩度，也影响着μ-钙蛋白酶活性和自溶程度[28]；且pH值下降越快，肌原纤维小片化的速率也快[29]；但是杜曼婷等[30]研究得出高低嫩度组在贮藏温度和环境相同的情况下，二者嫩度差异与宰后pH值的变化无关，但引起了酶活性差异，其主要调控因子还需进一步研究确定。

不同pHu间牛肉成熟过程中嫩度及嫩化速率存在显著性差异，Holdstock[31]及Jelenikova[32]等研究指出，pH值在6.1左右时嫩度最差，正常pHu（pH 5.40～5.80）和高pHu（pH＞6.1）组的肉嫩度较好，且高pHu肉嫩度优于正常肉的嫩度；Wu等[7]研究发现贮藏第一天的牛肉，高pHu组（pH 6.29～6.99）的剪切力最低，为95.06 N，低pHu组（pH 5.42～5.71）的剪切力为142.1 N，而中pHu组（pH 5.86～6.19）剪切力高达189.14 N。宰后pHu也影响着牛肉的嫩化速率，中pHu组（pH 5.8～6.2）的牛肉嫩化速率最慢，在成熟约3 d时，高pHu组（pH≥6.2）剪切力可达到44.1 N左右，符合大多数消费者对牛肉剪切力的接受阈值（42.14～48.02 N）[33]；宰后9 d时，低pHu组牛肉（pH＜5.8）的剪切力和宰后3 d的高pHu组的牛肉剪切力相当，基本达到消费者对牛肉嫩度的要求；而此时中pHu组的牛肉的剪切力仍处于较高水平，若需达到较好的嫩度还需要更长的成熟时间[34]。Wu等[7]也研究发现，在宰后的第1～2天时，3 组pHu值牛肉的嫩度便出现显著差异，贮藏28 d后，3 个pH值组牛肉剪切力均有下降，但中pHu组的剪切力仍显著高于其他两组。

3.2 不同pHu牛肉嫩度差异的潜在机制

牛肉的嫩度随着pHu从5.5上升到6.0左右而降低，从6.0升至7.0而增加[35]，不同pHu涉及不同的蛋白水解酶系统。有研究表明，骨骼肌中存在的一些酶体系对肌细胞骨架有关蛋白降解起到一定的作用，目前研究发现起主要作用的是肌钙蛋白酶，尤其是μ-钙蛋白酶的活性与宰后肌肉的嫩度密切相关，在高pHu下存在较高的μ-钙蛋白酶活性，以及在正常pHu下表现出更高的可溶性和与肌原纤维结合的组织蛋白酶活性。有学者通过研究僵直前期不同的温度对钙蛋白酶活性的影响研究，证明钙激活蛋白的激活程度与肌肉嫩度呈正相关[36]。通过μ-钙蛋白酶免疫印迹分析得出在宰后2～48 h内高嫩度组μ-钙蛋白酶60 kDa大亚基的初始含量高，但降解速率快，蛋白水解活性高于低嫩度组；由μ-钙蛋白酶络蛋白底物酶原分析得知，高嫩度组未自溶的μ-钙蛋白酶的初始含量高，但其自溶速率快，使其主要作用于宰后2～24 h[30]。

多数结构蛋白的降解与肌肉pHu有重要联系，高pHu组肌肉显示出更快的降解速率，低pHu组次之，中pHu组显示最慢的降解速率，这些蛋白的快速降解速率是影响肉嫩度的一个重要因素[7]。Penny等[37]通过研究不同pHu下牛肉肌浆中肌钙蛋白-T的降解情况，发现在高pHu（pH＞6.0）下，钙离子加速了肌钙蛋白-T的降解，在低pHu下肌钙蛋白-T被Ca离子非依赖性酶降解。通过对pHu分别为5.66与6.44的猪肉肌原纤维蛋白的降解规律进行比较，观察到肌钙蛋白-T、肌钙蛋白-I和纽蛋白的降解模式之间存在显著差异。高pHu组中的肌联蛋白、伴肌动蛋白、细丝蛋白的降解与μ-钙蛋白酶的快速自溶作用有关，当pHu增加到6.0以上时，可以增加肉的持水能力和蛋白酶（如钙蛋白酶和蛋白酶体）活性[38]。在低pHu组中，肌间线蛋白的降解与组织蛋白酶B水平的增加同时发生。

牛肉嫩度在不同pHu组具有明显的区别，其特征表现为成熟过程中不同pHu肌原纤维蛋白和骨架蛋白的降解规律不同，主要依据钙激活蛋白和组织蛋白酶的活性进行。研究发现高pHu牛肉的快速嫩化归因于μ-钙蛋白酶的快速活化促进了较大肌原纤维蛋白如肌联蛋白、细丝蛋白的早期降解；低pHu牛肉的嫩化被认为是由于在宰后早期μ-钙蛋白酶被激活，引起肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解[39]，以及成熟后期由残余的μ-钙蛋白酶和组织蛋白酶活性引起的肌间线蛋白的广泛降解[34]；而中pHu肉中钙激活蛋白酶和组织蛋白酶均不在最适的pH值范围，所以在相同的成熟时间，嫩化速率最慢，嫩度最差。中pHu值牛肉存在更复杂的蛋白水解酶系统，对中pHu值牛肉嫩度形成机制的研究，对于改善中pHu值牛肉的品质和利用率有着重要的经济意义。

4 保水性

肉的保水性又称为系水力和持水力，直接影响肉的滋味、香气、多汁性、营养成分、嫩度、肉色等食用品质，在生产过程中，较高的肌肉系水潜能可以提高产品的出品率。而较低的持水能力使肉类行业每年损失巨大[40]。宰后早期的pH值下降速率和程度，以及蛋白质水解甚至蛋白质氧化是影响肉类保持水分能力的关键。肌肉中的大部分水被包裹在细胞结构中，包括内部和外部纤维空间，因此，细胞内结构的关键变化影响肌细胞保持水的能力。随着尸僵的进行，肌原纤维中保持的水的空间减少，并且水分被迫进入肌原纤维外空间，此时容易造成汁液损失。如果将肌原纤维连接在一起，并且肌原纤维连接到细胞膜的蛋白质不降解，则在尸僵期间发生的肌原纤维的横向收缩可以传递到整个细胞。细胞骨架蛋白的有限降解可导致整个肌细胞的收缩增加，产生较大空隙，容易外渗造成汁液损失[28]。

pH值对系水力的影响本质上是蛋白质分子的净电荷效应。其对系水力具有双重意义，一是净电荷是蛋白质分子吸引水分的强有力中心；二是净电荷增加蛋白质分子之间的静电斥力，使结构松散，留下容水的空间[8]。鲜肉中的pH值对肌原纤维水的分布具有显著影响，因为与正常pH值相比，高pH值的肉中具有更均匀的孔径分布。有学者研究发现高pHu值猪肉的解冻损失和蒸煮损失显著低于正常pHu组，这表明最终pH值会影响冷冻解冻和熟肉中的水分流动和分布[41]。牛肉也有类似的特征，由于DFD牛肉的pH值偏离了肌原纤维等电点，带有的净电荷较多，增加了分子间的静电斥力，使肌肉松开而不易发生凝聚，并与肌肉中的游离水紧密结合，所以DFD牛肉的汁液损失和蒸煮损失比正常牛肉小，表明其系水力优于正常pHu的牛肉[1,9]，也反映出DFD牛肉的剪切力比正常牛肉低。

5 微生物

5.1 肉类微生物

肉的腐败是指在以微生物污染因素为主的多种因素作用下，微生物分解利用肉中的蛋白质和碳水化合物等营养物质进行生长繁殖，并产生不良代谢物的过程[42]。腐败通常发生在特定腐败菌增长到不可接受的水平，而特定微生物的腐败潜力取决于它们产生代谢物的能力[43]。微生物污染受到多种因素的影响，如屠宰时的刀具，肉类处理过程中的毛皮、粪便、空气或水，都是肉品微生物的污染源。有学者针对屠宰和分割对于牛肉微生物生长状况的影响进行研究，得出屠宰场是牛肉细菌污染的最初来源，进入屠宰工序后，部分微生物建立起生物膜，形成气溶胶，并促进向多批次肉类间的传播[44]。不同屠宰场采用的具体处理和卫生规程可能会进一步影响最初的微生物滋生演变[45]，对于肉类行业来说，全面有效地去污对于保证肉类安全和延长鲜肉的保质期是尤为重要的[46]。

5.2 不同pHu牛肉微生物的生长

对于牛肉而言，不同pHu的肉品，其微生物生长状况存在差异。正常牛肉在菌落总数达到7～8（lg（CFU/g））时会发生腐败，而DFD牛肉在菌落总数为6（lg（CFU/g））时就会发生腐败变质。高pHu的DFD牛肉允许正常pHu下被抑制的微生物生长，例如不动杆菌属和腐败杆菌[47]。与不同pHu牛肉腐败有关的菌种主要有：肉芽孢杆菌、肠杆菌、乳酸菌、假单胞菌、不动杆菌属以及热杀环丝菌等，这些腐败菌代谢造成酸味、变色和发黏等问题，其生长又与贮藏条件密切相关。

热杀环丝菌作为兼性厌氧菌，在有氧条件下，能够在低pH值（5.5～5.6）下生长，成为优势菌种；真空包装的牛肉，在冷藏温度下需要pH＞5.8以及在可渗透膜包装中存在少量氧气条件下生长。然而，Gribble等[48]研究了在真空包装条件下高、低pHu羔羊肉的热杀环丝菌和两种耐寒肠杆菌腐败特征，结果表明低pH值范围（5.5～5.8）的真空包装羔羊实验中，热杀环丝菌能够在-1.5 ℃的冷藏温度下生长并导致低pHu的羔羊腐败；在真空包装的肉模型中显示热杀环丝菌和肠杆菌在pH 5.8时无法生长，当pH 6.0时，导致肠杆菌科细菌快速繁殖。Shange等[49]研究冷藏（（5±1）℃）12 d且有氧条件下黑羚羊胸肌肉的正常pHu（pH＜6.06）和高pHu（pH＞6.06，DFD）样品的腐败程度，发现来自DFD和正常pHu样品的初始细菌计数没有显着差异，随着时间的推移，高pHu样品的好氧细菌和肠杆菌科细菌比正常pH值样品早4 d达到7（lg（CFU/ g）），DFD细菌生长速率比普通肉类高1.09 倍。

有学者将DFD牛肉货架期的缩短归因于高pHu，但是存在部分细菌不受pH值从5.5到7.0变化的影响[50]，如假单胞菌的生长速率不受肉类pH值变化的影响，pH值的升高对这类微生物生长的唯一影响是滞后期的缩短，对腐败发展所需的时间没有显著影响。DFD牛肉快速变质被认为是高pH值条件下缺乏糖原，DFD在正常pH值肉中，糖原是细菌的主要营养来源，一旦糖原耗尽，细菌就利用游离氨基酸作为营养，进而释放出副产物（如氨和硫化氢），使得肉中产生腐败气味。在高pH值（＞6.0）条件下，葡萄糖和糖酵解中间体的缺乏导致腐败菌群的加速生长，使细菌在肉类的早期阶段腐败的更明显[47]。

6 结 语

不同pHu之间，牛肉的食用品质和安全品质存在明显的差异，pH值的不同使得宰后牛肉内部发生不同的生化反应，从而表现出不同的肉色、嫩度、保水性和微生物的生长情况。

DFD牛肉所呈现出来的暗红色使消费者失去对其购买欲，造成了很大的经济损失。已有研究采用气调包装处理来改善DFD牛肉的肉色，其中高氧气调包装和一氧化碳气调包装改善效果显著，而其他改善肉色的措施鲜有报道，故研究如何改善肉色也成为一个热点。对于嫩度而言，高pHu组的嫩度最佳，正常pHu组的嫩度次之，中pHu组表现出的嫩度最差。影响肉嫩度的因素有很多，外源的影响导致宰后肌原蛋白的含量和成熟过程中的pH值下降速率不同，从而影响最终的嫩度及其嫩化速率。不同pHu下，存在不同的蛋白酶活性影响细胞骨架蛋白的降解程度，例如，高pHu牛肉由于μ-钙蛋白酶的快速活化促进较大肌原纤维蛋白早期降解，pH值与嫩度之间的关系复杂，尤其是对中pHu牛肉肉类嫩度的机理方面需要更深一步的研究。根据宰后肌肉的生化机理变化，找到相应的嫩化技术已经成为肉类研究者的主要研究方向，为生产更高品质的肉品提供了理论依据。

高pHu牛肉嫩度较好，但表面发黑，形成DFD牛肉，且易受微生物的污染，其货架期短。而对于不同pHu牛肉的微生物研究报道尚少。肉类贮藏过程中发生的化学变化被认为是揭示肉质或新鲜度指标的潜在手段，影响着肉类细菌群落结构的后续发展，也能够确定细菌生长动力学和肉类腐败率[51]。气调包装可以有效地改善牛肉肉色，且在贮藏前期表现出有效的抑菌效果，但是采用气调包装后，包装中的CO2气体可以被肉表面的水和脂质吸收直至饱和，使得肉中的pH值发生变化，进而可能影响肉的嫩度。目前对气调包装过程中不同pHu牛肉嫩度和微生物的变化研究还鲜有相关报道，如何提高不同pHu牛肉的食用品质和安全品质，降低牛肉产业的经济损失，是未来研究领域的一个热点。