植物多酚与花生致敏蛋白相互作用及脱敏机理研究进展

张 驰，李春翼，王启明，唐瑜婉，赵吉春,2，李富华,2，明 建,2,

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学食品贮藏与物流研究中心，重庆 400715）

花生是主要的食物致敏原之一[1]，花生过敏是血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导的I型超敏反应，其造成的影响具有致命性和持久性[2]，临床表现涉及皮肤、消化道、呼吸道等[3]。当前解决花生过敏的方法主要有物理热加工法、酶处理法、分子生物学方法等，它们仍存在诸多不足，如引入新致敏物质、破坏花生其他营养成分、适用范围窄等。植物多酚是一种天然植物活性物质，来源广、绿色安全，具有抗氧化、调节心血管疾病、抗炎、防治糖尿病等生理功能，某些与蛋白质具有良好的结合能力[4-5]，利用植物多酚与花生致敏蛋白相互作用是解决花生过敏的一项新途径，已有文献报道植物多酚可以降低花生蛋白致敏性。本文对植物多酚与花生致敏蛋白的相互作用、脱敏的潜在机理进行综述，总结目前该领域的研究进展，并对今后的发展进行展望。

1 花生过敏

1.1 花生致敏蛋白

花生主要致敏原物质是高度糖基化的致敏蛋白，多属花生种子贮藏蛋白，微量即可导致过敏[6-7]。目前世界卫生组织/国际免疫学会联合会过敏原命名小组委员会已公布并命名了17 种花生致敏蛋白，分别为Ara h 1～Ara h 17。在所有致敏蛋白中，Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6是较为重要的致敏蛋白类型[3]。

1.2 花生过敏的一般过程

花生过敏包括致敏阶段和效应阶段。1）致敏阶段：胃肠道黏膜上的特化上皮细胞——M细胞（一种抗原转运细胞）将致敏蛋白转移至抗原呈递细胞，后者将其加工处理成肽片段，在主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）/T细胞受体（MHC呈递的多肽与T细胞受体特异性结合，引发后续生化反应）作用下将肽先呈递给T细胞，再呈递给未成熟的辅助型T细胞2（T helper 2 cell，Th2），Th2被激活后产生细胞因子，刺激B细胞合成花生特异性IgE抗体[8]。2）效应阶段：致敏原与结合在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的花生特异性IgE结合，后者主要通过高亲和力的表面IgE受体FcɛRI结合在相关细胞上，释放多种炎症介质，如组胺、前列腺素、白三烯等，具体过程见图1。此外，局部产生肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-5（interleukin-5，IL-5）和趋化因子使嗜酸性粒细胞激活与聚集[8]。刘志刚等[9]发现花生过敏小鼠模型体内以嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞为主的炎症细胞数目显著增加，肥大细胞活化状态明显，血清中花生过敏原特异性IgE和白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等细胞因子水平以及腹腔上清液组胺水平显著增高（P＜0.05），IgG2a（免疫球蛋白G的亚类）和γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）水平极显著降低（P＜0.01）。

图1 食物过敏反应的细胞机制[10]Fig. 1 Cellular mechanisms of allergic responses to food[10]

2 常见花生脱敏方法与原理

目前，食品工业中常见的花生脱敏方法主要有：物理热加工法、基因工程方法、发芽处理法、酶处理法和辐照处理法，它们对花生产生脱敏作用的原理各不相同。

2.1 物理热加工法

常见的物理热加工法包括水煮、焙烤、油炸等[11]。热加工引起致敏蛋白高级结构改变，使表面抗原决定簇包埋或暴露，进而影响蛋白的IgE结合能力，降低或增加其致敏性[12-14]。Maleki等[15]报道了烘烤花生结合特异性IgE的能力比未处理花生高出约90 倍，花生致敏蛋白的美拉德反应产物增强了其致敏性。李颖超[12]采用烘焙、油炸、水煮、高温高压处理花生仁，其可溶性蛋白含量减少，过敏原反应性分别降为对照组（未经任何处理）的92%、73%、92%和28%。

2.2 基因工程法

利用基因工程方法可在分子水平上对致敏原相关基因进行操作，这种方法是通过改变花生内源基因从根源上改善蛋白致敏性[7]。易海涛等[16]制备了经点突变的花生主要致敏原Ara h 2，体外实验表明该重组蛋白具有低致敏性潜能。Chu Ye等[17]通过沉默Ara h 2和Ara h 6基因得到了低致敏性花生。基因工程改造的花生可能存在缺乏原有花生的风味和营养价值等问题[18-20]。

2.3 发芽处理法

发芽处理法是利用在种子发芽过程中，一些贮藏蛋白类致敏蛋白降解成多肽或氨基酸以供给种子生长所需的氮源，从而降低花生致敏原含量[12,21]。李颖超[12]发现花生发芽84 h和132 h后，致敏蛋白免疫抑制率较36 h时分别下降了6.6%和11.5%。

2.4 酶处理法

酶处理法主要包括酶交联技术和酶分解技术。酶交联技术通过催化蛋白质内部或分子间形成共价键而发生交联反应，改变蛋白质空间结构，从而引起致敏性变化，目前可用的酶有：谷氨酰胺转氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等[22]。Radosavljevic等[23]使用酪氨酸酶处理花生全蛋白，交联产物致敏性未发生改变。Chung等[24]采用过氧化物酶处理焙烤花生，其酪氨酸残基发生了交联，致敏性显著降低；随后该团队又证明了多酚氧化酶可使花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2形成交联，从而降低其致敏性[25]。Mihajlovic等[26]利用微生物多酚氧化酶和漆酶交联花生致敏原，提升了花生致敏性。

酶分解技术则是通过分解致敏蛋白破坏致敏表位结构，降低其与IgE的结合特性，进而降低花生蛋白致敏性。目前常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶[12,21]等。石振鹏等[21]采用一种复合酶制剂（V（碱性蛋白酶）∶V（中性蛋白酶）∶V（木瓜蛋白酶）∶V（风味酶）＝2∶2∶1∶1）花生仁浆，处理后花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2平均消减率为92.91%。利用微生物发酵法也可分解致敏蛋白从而达到降敏效果，周阳[27]的研究表明，花生蛋白液经枯草芽孢杆菌发酵后与IgE结合能力可下降为零，发酵液中Ara h 1几乎被消除，Ara h 2含量明显减低。纳豆芽孢杆菌发酵可使花生蛋白液与IgE结合能力下降48%。Hazebrouck[28]和Yu Jianmei[29]等发现胰蛋白酶能水解花生过敏原，有效降低花生过敏原性。

2.5 辐照处理法

辐照处理可以加速蛋白交联、展开、形成碎片及生成新的反应基团，从而改变蛋白结构，影响蛋白免疫反应性[30-31]。Luo Chunping等[32]利用10 kGy的钴-60 γ射线辐照剂量处理Ara h 6和花生蛋白总提取物，发现其IgE结合能力下降，蛋白质二、三级结构明显改变。

以上方法在使用过程中分别具有不同优缺点，具体如表1所示。

表1 常见花生脱敏方法优缺点比较Table 1 Comparative advantages and disadvantages of methods commonly used for allergenicity reduction of peanuts

利用植物多酚与花生致敏蛋白相互作用是解决花生过敏的一项新途径，已有文献报道植物多酚与花生致敏蛋白相互作用可以降低花生蛋白致敏性。例如蔓越莓多酚和蓝莓多酚与花生蛋白形成复合物后，在体外实验中能降低花生蛋白与花生特异性IgE的结合能力[36]；人类临床I期实验证明多酚配方能降低过敏反应中的嗜碱性细胞数量[37]；经蔓越莓多酚强化的花生粉在体外实验中诱导的嗜碱性细胞脱颗粒现象和经口刺激花生过敏小鼠体内肥大细胞脱颗粒现象均显著减少[38]；花生蛋白与多酚结合还可降低小鼠体内特异性IgE的含量[39]。

3 植物多酚与花生致敏蛋白的相互作用

3.1 相互作用力类型

植物多酚与花生致敏蛋白的相互作用力类型包括共价作用力（如经多酚氧化、亲核加成等形成）和非共价作用力（氢键、范德华力、疏水相互作用、静电相互作用等）。对蔓越莓和蓝莓果渣多酚与花生蛋白形成的复合物进行多酚提取鉴定，发现多酚以游离、共价结合和非共价结合3 种形式存在，且游离多酚含量最高，共价结合多酚含量最低[36]，以苷元或糖苷形式存在的槲皮素与花生蛋白以共价形式结合，多聚和单聚原花青素则以非共价形式与花生蛋白结合[36]。

3.2 结合位点

图2 大豆β-伴大豆球蛋白（A）和大豆球蛋白（B）的三维结构[41]Fig. 2 Three-dimensional structures of soybean β-conglycinin (A)and glycinin (B)[41]

植物多酚与花生致敏蛋白的结合位点可能在蛋白质中的脯氨酸富集区、二硫键处、蛋白质侧链残基上。van Boxtel等[40]依据Ara h 1、Ara h 3的三维结构分别与β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白相似（图2），推测蛋白结构中的脯氨酸富集区是原花青素与花生致敏蛋白的结合位点，Ara h 1含有脯氨酸富集区，因此易与原花青素形成交联；Ara h 3中脯氨酸排列松散，因此对原花青素亲和力小，不易形成交联。

植物多酚与花生致敏蛋白的结合位点还可能位于二硫键处。分子内的二硫键常使蛋白质对热刺激更具稳定性，增强其致敏能力[30]。Ara h 2分子内含有的4 个保守二硫键，可维系结构稳定性，保证与IgE结合的活性和致敏性，天然Ara h 2具有胃肠道消化酶耐受性，且酶解后仍具识别IgE能力，若二硫键被还原，则极易被酶解且与IgE的结合活性下降[42]。

研究发现，蛋白质侧链的氨基酸残基处也可能是多酚与致敏蛋白的结合位点之一。多酚氧化产物醌类是高活性的亲电中间体，易被氨基酸侧链中的亲核位点攻击进而发生亲核加成反应，半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸等氨基酸残基上常具有亲核位点[36]。Chung等[25]证明酚类化合物咖啡酸在碱性条件（pH值大于10）可以被氧化成醌类物质，进而与蛋白质中的氨基、巯基或色氨酸残基作用形成蛋白质交联，降低花生蛋白致敏性，反应过程如图3所示。

图3 咖啡酸在pH 10.5时交联蛋白质[25]Fig. 3 Cross-linking of protein by caffeic acid at pH 10.5[25]

3.3 结合特征与构象变化

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和花生致敏蛋白Ara h 2、Ara h 6的结合亲和力、结合常数和结合位点的数目与EGCG和其他球蛋白结合时相似，结合后Ara h 2和Ara h 6均出现相似变化，即α-螺旋含量减少，β-折叠与β-转角含量增加[43]。

3.4 影响因素

目前发现能降低花生蛋白致敏性的多酚种类包括原花青素[40]、以苷元或糖苷形式存在的槲皮素[36]、咖啡酸[25]、大豆异黄酮[44]、绿原酸和苯甲酸[45]等。影响蛋白和多酚相互作用的常见因素包括温度、pH值、多酚和蛋白的类型及浓度等[5]。温度和pH值可能通过影响反应速率、反应物活性、反应物所带电荷数等影响植物多酚与花生蛋白的相互作用，多酚和蛋白的类型及浓度产生的影响可能在于多酚、花生致敏蛋白本身结构特征的差异，如某种基团的数目和所含特征化学键等，但目前在植物多酚与花生致敏蛋白相互作用研究中鲜有系统考虑以上因素。

4 植物多酚降低花生蛋白致敏性的潜在机理

植物多酚降低花生蛋白致敏性的机理可能有两种：1）单独植物多酚对过敏反应的干扰作用；2）植物多酚与花生致敏蛋白形成复合物，掩蔽或改变致敏蛋白结构，间接调节过敏反应。

4.1 单独植物多酚对过敏反应的干扰作用

单独植物多酚可以通过抑制化学介质释放和抑制肥大细胞、嗜碱性细胞或T细胞产生细胞因子、信号转导和基因表达从而干扰过敏反应[46]。绿茶中的EGCG及其甲基化衍生物(-)-表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate，EGCG3''Me)可通过抑制人外周血嗜碱性白细胞KU812中的FcɛRI受体表达从而减弱过敏反应[47]。单独加入蔓越莓多酚或蓝莓多酚时，肥大细胞的组胺释放量和β-氨基己糖苷酶释放量出现不同程度降低[36]。植物多酚的抗过敏作用具有非特异性，如类黄酮能够通过抑制DC的功能抑制小鼠模型中的花生过敏[44]。可可中的原花青素低聚物可以刺激先天性和早期适应性免疫，这种抑制DC和巨噬细胞的功能不是针对某种特异的抗原，不具有致敏原特异性[46]。

4.2 植物多酚与花生致敏蛋白形成复合物导致后者结构改变，间接调节过敏反应

花生致敏蛋白和植物多酚结合可以引起其构象变化，进而改变抗原表位结构特性，最终影响抗原结合能力，改变蛋白致敏性[13,30,48-49]。花生致敏蛋白Ara h 2、Ara h 6和EGCG结合后致敏性降低，蛋白螺旋结构含量减少，β-折叠及无规卷曲含量增加，结构稳定性下降[44]。分别用蔓越莓多酚和蓝莓多酚与花生蛋白制备含质量分数30%多酚的复合物，与未加多酚的对照组相比，蔓越莓多酚和蓝莓多酚制得的复合物与IgE结合能力分别下降38%、31%，并使离子霉素诱导的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞（rat basophil leukemia cells，RBL-2H3）的组胺释放量分别下降65.5%、65.8%，β-氨基己糖苷酶释放量分别下降60.7%、45.4%[36]。花生蛋白与浆果多酚结合后与IgE结合能力下降，且蛋白二级结构发生变化[50]。此外，大多数食物致敏原均具有高胃肠道消化酶抵抗性[48]，富含EGCG的绿茶多酚提取物与花生致敏蛋白结合后可促进胃蛋白酶对抗消化食物过敏原的消化，从而降低致敏作用[49]。

植物多酚与花生致敏蛋白结合可抑制过敏反应中的相关信号通路。如在速发型过敏反应中，Ca2+内流可引起肥大细胞脱颗粒作用[36]，花生衣中的多酚与花生蛋白形成聚合物后可抑制Ca2+诱导的丝裂原活化蛋白激酶信号通路引起的细胞脱颗粒[51]。植物多酚-花生蛋白复合物的致敏性降低可能包括3 个原因：1）消化酶更易于破坏复合物中IgE的结合表位；2）多酚结合的蛋白表位不能被致敏原特异性IgE识别；3）交联蛋白使表位不能被含致敏原特异性的IgE肥大细胞和嗜碱性细胞在消化过程中识别[52]。

5 结 语

目前关于植物多酚降低花生蛋白致敏性的研究内容主要集中于测定花生致敏蛋白与多酚结合前后的以下指标：在体外与特异性IgE的结合能力、对肥大细胞脱颗粒作用的抑制能力（测定β-氨基己糖苷酶和组胺释放水平）、经胃肠道酶消化后花生蛋白的组成及含量等，对花生致敏蛋白与植物多酚的相互作用和脱敏机理的深入研究及报道较少。

未来的研究方向可能包括：1）深入探讨植物多酚脱敏作用机理，关注相关信号的基因表达等；2）探究致敏蛋白和植物多酚的相互作用如作用力类型、结合常数、结合位点等，找到致敏蛋白中决定脱敏作用的结构变化；3）关注不同多酚组合类型的脱敏效果；4）关注植物多酚在胃肠道消化过程中对消化酶及肠道菌群的作用；5）关注其他食物基质对花生致敏蛋白的影响。