线粒体DNA变异检测在卵巢癌临床诊治中的研究进展

汪梦馨 高天 刘洋 刘淑娟 邢金良

作者单位：710000 西安 1空军军医大学第一附属医院妇产科；010110 呼和浩特 2内蒙古医科大学基础医学院；710032 西安 3空军军医大学基础医学院生理与病理生理教研室

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，因早期缺乏典型症状和体征以及有效的早期诊断方式，约75%的患者确诊时已处于晚期［1-2］。早期患者5年生存率可达71%～93%［3-4］，而晚期患者仅为 29%［4］。因此，开发早期诊断和精准治疗标志物，对延长患者生存期十分关键。目前卵巢癌临床上常用的诊断方法主要包括血清学检测［糖类抗原 125（CA125）联合人附睾蛋白 4（HE4）］和经阴道 B 超检查（transvaginal sonograph，TVS）［5］等。CA125在卵巢癌早期诊断中灵敏度较低，仅为50%；TVS在卵巢癌诊断中灵敏度为90.63%，特异度为88.57%，可以帮助诊断伴有卵巢明显增大的卵巢癌，但对于病灶不明显的卵巢癌，诊断效果不理想［6］。线粒体是几乎存在于所有真核细胞中的重要细胞器，每个细胞都包含多个拷贝的线粒体基因组［7］。已有研究表明，几乎所有类型的肿瘤组织中均可检测到mtDNA变异，且其引起的线粒体功能障碍与肿瘤发展和转移关系密切。近年研究［8］表明，肿瘤组织或转移灶中的mtDNA可释放到外周血循环中，因此检测外周血循环中的mtDNA变异在肿瘤早期诊断、肿瘤进展以及转移方面有巨大的应用前景［9］。本文将对卵巢癌中mtDNA变异检测及其临床应用进行综述。

1 mtDNA变异与卵巢癌

mtDNA变异主要分为两大类：“质变”和“量变”。“质变”包括单碱基替换、短片段插入或缺失、长片段缺失等；“量变”主要指mtDNA拷贝数变异。

1.1 mtDNA“质变”与卵巢癌

1.1.1 单碱基替换 单碱基替换又称点突变，是肿瘤细胞中最常见的mtDNA变异。肿瘤中点突变存在明显偏倚：G-A突变频率最高，T-C突变频率次之，A-G和C-T突变频率再次之，但均显著高于其他类型的点突变［10］。且卵巢癌中的mtDNA突变大多数是T-C或G-A跃迁［11］。LIU 等［12］报道约 60%的卵巢癌中存在mtDNA点突变。同其他肿瘤［13］一样，卵巢癌中mtDNA的点突变多发生在非编码区，即D环（D-loop）区，可能是由于D-loop区具有独特的三链结构而更易产生突变。而mtDNA D-loop区点突变与较低的mtDNA拷贝数和较差的预后密切相关［14］。KONG 等［15］针对 89例原发性上皮性卵巢癌患者血液样本的游离mtDNA D-loop区进行靶向测序，结果发现D-loop区的突变与上皮性卵巢癌患者的临床结局相关。以上研究结果说明，检测mtDNA D-loop区点突变有助于明确患者基因型，预测患者预后。

同其他肿瘤一样，卵巢癌中mtDNA突变最常发生的位置除了 D-loop 区，还有 ND4、ND5、ND1、cytb 等区域［16］。而发生在编码区的突变可能影响mtDNA的转录，从而影响线粒体功能。如ND5基因编码复合物Ⅰ的核心亚基，而该亚基对线粒体呼吸链中还原型辅酶（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）到泛醌的电子传递至关重要，ND5出现突变或与复合物Ⅰ相关的基因（如ND4）出现缺陷，都可能导致线粒体氧化磷酸化损伤以及活性氧生成增加，从而导致肿瘤增殖和转移［17］。此外，cytC基因中的mtDNA改变也可能阻碍细胞凋亡过程，而mtDNA ATP合酶亚基6（MTATP6）基因的突变可能通过抑制细胞凋亡而促进癌症的发生［18］。

1.1.2 短片段的插入或缺失 迄今为止，已有一百种mtDNA短片段插入缺失在肿瘤细胞中被发现。研究显示，卵巢癌中易出现插入/缺失的位置是位于np303-309、np568-573 区域［11］。尽管如此，大部分已报道的mtDNA插入缺失变异呈随机分布，且未发现与恶性肿瘤的发生发展有显著相关性。HUNG等［19］研究发现，不同类型的癌组织中，约5%的组织在上述两处区域存在插入，然而在相应癌旁组织中也可检测到上述插入突变，因此认为短片段的插入或缺失不具有肿瘤特异性。

1.1.3 长片段缺失 在肿瘤细胞mtDNA中，np8470/8482至np13447/13459之间总计4 977 bp的缺失是最常见的线粒体DNA大片段缺失［20］，被命名为“常见缺失”。缺失的4977 bp片段中包含了7个氧化磷酸化亚基编码基因（ATP6、ATP8、COXIII、ND3、ND4L、ND4、ND5）和5个tRNA编码基因，因此此片段的缺失严重影响线粒体正常功能。在子宫内膜癌［21］和宫颈癌［22］研究中发现，mtDNA 4977 bp片段的积累可能与患者衰老过程有关，尤其体现在围绝经期妇女中。在卵巢癌［23］研究中发现，与卵巢恶性肿瘤组织中几乎未检测到缺失相比，卵巢良性肿瘤组织中mtDNA 4977 bp缺失率达63%，差异有统计学意义，与在乳腺癌、胃癌、头颈部肿瘤［24］和直肠癌［25］中进行的研究结果一致。出现这一现象的原因一方面可能是肿瘤细胞大量扩增导致带有缺失的细胞总量下降，另一方面可能是大量缺失细胞存在代谢异常，恶性肿瘤在大量扩增过程中通过凋亡的方式淘汰这些细胞［26］。但是总体而言，卵巢癌中有关长片段缺失方面的研究极少，仍有待进一步研究。

1.1.4 微卫星不稳定 微卫星是遍布于人类基因组中的短串联重复序列。微卫星不稳定（micro satellite instability，MSI）是指DNA甲基化或者基因突变导致错配修复基因缺失，从而导致微卫星重复序列插入或缺失，继而导致DNA长度发生改变，这一过程与肿瘤发生密切相关［27］。线粒体微卫星不稳定性（mitochondrial micro satellite instability，mtMSI）被定义为正常组织和肿瘤组织之间mtDNA短碱基重复序列长度的变化。而mtMSI是人类肿瘤中常见的事件［28］。在女性生殖系统肿瘤中，MSI多见于子宫内膜癌［29］。而在卵巢癌中，MSI更常见于子宫内膜样卵巢癌［30］。发生在卵巢癌中的mtMSI，其中在D-loop区最常见。WANG等［11］在73例原发性卵巢癌体细胞标本中提取mtDNA，发现mtMSI在卵巢癌早期肿瘤细胞中较常见，且含量显著高于晚期肿瘤细胞，但样本量较小，这一结论有待进一步研究。

1.2 mtDNA“量变”与卵巢癌

mtDNA作为电子传递链的必要模板，其拷贝数的多少在一定程度上决定了细胞的氧化还原能力。据统计，在能量密集型组织（如心脏和骨骼肌）中，每个细胞中含有4 000～6 000个mtDNA拷贝，而肝脏、肾脏和肺组织中平均含有500～2 000个拷贝［31］。与其他肿瘤组织相比，卵巢癌组织中mtDNA拷贝数明显增多［10，32］。且越来越多的证据表明，卵巢癌患者与健康人的血浆或血清游离mtDNA（cf-mtDNA）拷贝数水平存在显著差异［33］。ZACHARIAH 等［34］研究亦发现上皮性卵巢癌与良性上皮性卵巢肿瘤、子宫内膜异位症患者和健康对照者相比，血浆cf-mtDNA水平显著升高。热孜婉古丽·吾布力等［35］检测30例卵巢癌患者、30例卵巢良性肿瘤患者和60名健康志愿者的外周血样本，发现卵巢癌患者血浆中cf-mtDNA含量明显高于其余两组。因此认为，mtDNA拷贝数变异在卵巢癌诊断中起重要作用。

2 mtDNA变异在卵巢癌中的临床应用

2.1 早期诊断

如前所述，尽管目前卵巢癌诊断已有多种成熟的方法，但是因特异度或灵敏度不理想，在临床上使用效果不理想。随着二代测序技术的快速发展，mtDNA变异被广泛应用于区分卵巢癌患者和健康者。越来越多的研究表明，检测mtDNA拷贝数变异可能有助于从无症状人群中识别患者［18］。ZACHARIAH等［34］研究报道，血浆cf-mtDNA数量与传统的预测指标，如肿瘤分期、肿瘤体积和CA125等无相关性，提示cf-mtDNA可能是卵巢癌患者血液循环中的独立标志物，可用于肿瘤的早期诊断。但是在卵巢癌的早期阶段，单纯进行CA125检测灵敏度并不高。而对于卵巢癌，早期进行cf-mtDNA拷贝数检测，灵敏度为79%，特异度为63%［34］。尽管该实验中mtDNA检测在早期诊断的灵敏度上表现出一定优势，但特异度仍不高，且近年来缺乏相关研究，因此mtDNA变异在卵巢癌早期诊断中的应用价值仍有待进一步探索和研究。

2.2 鉴别诊断

卵巢癌患者往往双侧卵巢均受累，然而位于两侧卵巢之间的子宫却极少受累。且双侧卵巢同时出现病灶时是同时发生，还是一侧癌细胞经由腹膜播散到了对侧？mtDNA测序的应用或许可以帮助临床医师解答这些疑问。VAN TRAPPEN等［36］对35例卵巢癌患者的52个不同肿瘤样本以及匹配的正常组织的D-loop区进行了测序，其中17例为双侧卵巢癌，这17例中有13例患者双侧卵巢病灶的mtDNA变异相同，4例不同；而来自同一患者的多个肿瘤样本可能含有不同的mtDNA变异，且腹腔内转移灶至少与一侧卵巢病灶的突变相同。

体内同时出现两种不同肿瘤，这种情况在卵巢癌和子宫内膜癌中较常见［37-39］。mtDNA基因分型可以揭示检测到的子宫内膜癌和卵巢癌是否同时发生。此外，在交界性卵巢肿瘤和腹膜浅表病变中也存在此情况，mtDNA测序被证明具有较好的鉴别效果。GIROLIMETTI等［40］对8例同时存在交界性卵巢肿瘤和腹壁种植物的患者进行了mtDNA测序，以评估其克隆性，结果发现37.5%的病例中，交界性卵巢肿瘤和腹膜种植物中都存在相同的mtDNA突变，这表明种植物可能是单一卵巢部位扩散的结果。

2.3 肿瘤进展监测

在乳腺癌等肿瘤研究［41］中，不同阶段的mtDNA水平已被证实可用于肿瘤进展监测。在卵巢癌中mtDNA水平也同样可作为监测肿瘤进展的标志物。卵巢癌患者mtDNA拷贝数增高的水平是否会随着肿瘤的进展而变化？WANG等［32］研究发现，mtDNA拷贝数变异与卵巢癌患者年龄、肿瘤分期无关，但肿瘤病理分级较低的患者mtDNA拷贝数显著高于中高分级患者。然而，ZACHARIAH等［34］研究表明血浆中的cf-mtDNA可用于评估肿瘤分期。KESER等［42］收集了24例卵巢癌患者（其中Ⅰ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者各8例）和24名健康志愿者的外周血标本进行研究，结果发现，晚期卵巢癌患者的mtDNA拷贝数明显高于其他组，早期卵巢癌患者的mtDNA拷贝数也显著高于健康志愿者。MENG等［43］将165例卵巢上皮性癌患者和60名健康志愿者外周血标本中mtDNA上16s RNA基因的79-bp（短）和230-bp（长）片段进行扩增，结果发现，与健康志愿者相比，卵巢上皮性癌患者的mtDNA 79和mtDNA 230水平显著升高，说明mtDNA小片段的增加与肿瘤进展有关，该研究还发现mtDNA 79和mtDNA 230的高水平与晚期病理特征和转移潜能相关（腹膜及远处转移）。以上研究说明，mtDNA拷贝数变异可能是卵巢癌进展中的重要事件，但是目前相关研究仍较少，两者的关系研究可作为下一步的研究方向。

2.4 化疗疗效监测

卵巢癌常用的一线化疗方案是以铂类药物为基础，紫杉类药物为辅。同大多数恶性肿瘤一样，长期使用铂类药物化疗的卵巢癌患者可能产生铂类药物耐药性，从而减弱化疗效果，甚至治疗无效。近年来，学者们试图通过对肿瘤中的mtDNA变异研究，找到机体对铂类药物产生耐药性的原因。史宏晖等［44］检测7例初治卵巢癌患者和同期经若干疗程化疗后复发的9例卵巢癌患者肿瘤组织及其周围正常组织中的mtDNA，发现与初治患者相比，化疗后复发的患者mtDNA多态性变化位点明显增加，而mtDNA突变无明显增加。以上结果提示，mtDNA多态性变化与突变的发生机制可能存在差异。多态性变化可能与化疗等外界因子有关，对线粒体功能的影响较小；而突变可严重影响线粒体功能，可能是肿瘤组织固有的，可反映疾病的特性并决定疾病的发展和预后。该研究后续进一步针对20对卵巢癌组织及其癌旁组织，以及2个卵巢癌细胞系及其4个铂耐药细胞系（SKOV3，A2780等）的mtDNA进行测序，并比较了两组患者与两种细胞系的mtDNA变异、氨基酸改变的相关性。结果发现无论在体内还是体外研究中，mtDNA损伤均可能由化疗药物造成。对比同一复发患者两次化疗前后的组织标本，发现其肿瘤组织中的mtDNA突变数量未明显增加，说明在卵巢癌中mtDNA损伤可能并不严重［45］。由于该研究的样本量较小，因此其研究结果有待进一步研究。

目前已有大量研究者致力于在卵巢癌细胞系中寻找卵巢癌细胞对铂类药物耐药的原因。赵晋等［46］发现，在人卵巢癌耐药细胞株中mtDNA点突变明显高于敏感细胞株，推测突变的增加可能与卵巢癌耐药性有关。KLEIH等［47］报道与耐顺铂诱导细胞凋亡的细胞相比，顺铂敏感的卵巢高级别浆液性上皮性癌细胞系含有更多的线粒体拷贝数和更高水平的线粒体ROS（mtROS）。也有研究表明，在人卵巢癌细胞（OVCAR-3）克隆亚系中，线粒体拷贝数和基础耗氧量与顺铂诱导的细胞凋亡敏感性相关。GIROLIMETTI等［48］报道，接受铂类药物治疗后，癌细胞中的mtDNA会被诱导，经紫杉醇阳性筛选后，存在mtDNA突变的线粒体，其呼吸功能、增殖和致瘤潜能、迁移和侵袭能力均下降，说明铂类药物诱导的有害mtDNA突变会产生对紫杉醇的耐药性。此外，检测mtDNA拷贝数的变异也可用于监测化疗药物疗效。KALAVSKA等［49］检测67例卵巢癌患者mtDNA含量，其中25例接受紫杉醇+卡铂化疗，42例接受紫杉醇+卡铂+贝伐珠单抗化疗，6个周期化疗后检测，结果显示mtDNA含量均明显下降。

3 小结与展望

以往对卵巢癌mtDNA变异的研究大多在卵巢组织中进行，因难以取样，研究样本普遍较少，因此研究结论意义有限。但随着检测技术的发展，可更好地使用石蜡切片和外周血标本中的mtDNA对肿瘤进行研究，可减轻对患者损伤，同时也可以获得更加充足的样本量，是将来进行深入研究的重要手段。但目前mtDNA变异在卵巢癌早期诊断和治疗监测中的作用仍所知甚少，未来还需进一步对mtDNA变异在卵巢癌早期诊断、手术前后、复发前后及化疗前后等诊疗效果监测方面进行更深入的研究，以明确mtDNA突变作为卵巢癌可靠生物标志物的价值，以进一步提高卵巢癌患者的预后，改善生存质量。