UPLC-MS/MS法检测洁白制剂中沉香的使用情况

武嘉庚，杨凤梅，张 炜，范莹莹

0 引言

“洁白”系列品种分为丸剂和胶囊剂2种剂型，皆为生粉入药，其中水丸规格为0.8 g/丸，薄膜衣丸规格为0.8 g/4丸，胶囊剂规格为0.4 g/粒。洁白胶囊(丸)系治疗消化道疾病的经典验方，因其疗效确切，应用于藏医临床有近千年的历史，2种剂型处方一致，皆由诃子(煨)、寒水石、翼首草、五灵脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰华、红花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等14味中、藏药材组成。主要功效为健脾和胃，止痛止吐，分清泌浊。用于胸腹胀满、胃脘疼痛、消化不良、呕逆泄泻、小便不利等症。沉香在方中虽然用量不大，却是洁白胶囊(丸)中重要的一味药[1]。

沉香为瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有树脂的木材，功能为行气止痛，温中止呕，纳气平喘。沉香主治胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急[2-3]。其价格近年来逐步攀升。不少企业为了追求利润，不惜以次充好，有意无意使用劣质沉香。笔者经过前期调研和考查藏族用药习惯，发现部分藏药企业在生产过程中以山沉香代替沉香入药，鉴于目前约有数百种中成药需要沉香进行复方配伍，这一情况严重影响了成药的疗效[4-7]。

《中国药典》2015年版一部收载的洁白丸质量标准、《国家药品标准》(新药转正标准第二十册)WS3-175(Z-165)-98(Z)和《中华人民共和国卫生部药品标准》(新药转正标准 第十五册)WS3-175(X-165)-97(Z)收载的洁白胶囊质量标准中均无沉香药材质量控制手段。在前期实验中，笔者使用HPLC法测定沉香四醇含量时，发现阴性制剂在沉香四醇色谱峰处有干扰，为了控制洁白胶囊(丸)中沉香质量，对厂家的沉香投料情况进行评价，我们建立了UPLC-MS/MS测定洁白胶囊(丸)中沉香四醇的方法，以检测洁白胶囊(丸)中沉香的使用情况[8]。

1 仪器与材料

THERMO TSQ QUANTUM ULTRA液质联用仪。电子天平(Sartrious BSA 224S-CW,德国Sartrious公司);超声波清洗器(KQ5200B，昆山市超声仪器有限公司);沉香四醇对照品(购自中检院，批号:16032214，纯度99.96%);乙腈为色谱纯，水为超纯水;其他试剂均为分析纯;沉香、山沉香、诃子(煨)、寒水石、翼首草、五灵脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰华、红花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等药材购自亳州康美中药城，经青海省药品检验检测院杨凤梅主任鉴定为正品;洁白胶囊(丸)均为市售样品，涉及4家企业，共50个批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Zorbax Eclipse Pluse C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);以乙腈-0.1%甲酸溶液(75∶25)为流动相;等度洗脱;体积流量：0.3 ml/min;柱温:40 ℃，进样量2 μl。

2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI±)，离子源温度:350 ℃;毛细管温度:270 ℃;鞘气流速:10 L/min;辅助气流速:5 L/min;毛细管电压:3 600 V;透镜补偿电压 55 V;扫描模式为质谱多反应监测(MRM)，具体参数设置见表1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取沉香四醇对照品0.013 2 g，置200 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取对照品溶液4 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，按纯度99.96%计，每1 ml约含沉香四醇5.28 μg。

2.3.2 供试品溶液的制备 洁白胶囊(丸)供试品溶液的制备方法一致，皆为取洁白胶囊(丸)样品(过三号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 ml，称定重量，浸泡0.5 h，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)1 h，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液，用微孔滤膜(0.26 μm)滤过，即得。

2.3.3 阴性及阳性溶液的制备 取按洁白胶囊(丸)的处方比例除去沉香制成阴性样品，依照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法，模拟制成沉香阴性对照溶液。取原料药材，按处方、工艺制得洁白胶囊(丸)阳性样品，同“2.3.2”项下供试品溶液制备法制成阳性溶液。

2.3.4 山沉香药材溶液的制备 取山沉香药材(过三号筛)约2 g，精密称定，依照“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法，制成山沉香药材溶液。

2.3.5 测定条件 分别精密吸取上述5种溶液各2 μl，注入液质联用仪，进行HPLC-MS/MS分析。色谱图见图1。由测定结果得知，沉香对照药材及阳性样品溶液分别仅检测出与沉香四醇对照品保留时间相同的MRM选择离子峰，子离子丰度比基本一致。山沉香药材溶液和阴性样品图谱中未出现与沉香四醇对照品一致的离子峰，可见阴性在此位置上无干扰。

2.4 沉香四醇方法学考察

2.4.1 稳定性、精密度和重复性 取“2.3.1”项下沉香四醇对照品溶液(5.28 μg/ml)，连续进样6次并记录峰面积。结果显示，沉香四醇峰面积RSD为0.25%(n=6)，表明仪器的精密度良好;取“2.3.2”项下供试品溶液(批号:21141)，室温放置2、3、8、12、18、20 h时进样并记录峰面积，结果显示，沉香四醇的峰面积RSD为0.65%，表明样品在室温24 h内稳定;取供试品适量(批号:21141)，按“2.3.2”项下方法制备6份平行样品，分别进样并记录峰面积，结果显示，沉香四醇峰面积的RSD为0.58%，表明此方法重复性良好，见表2。

表1 沉香四醇含量测定标准谱库信息

图1 对照品及样品HPLC-MS/MS 分析图

2.4.2 加标回收率 取已知含量样品(批号:21141)2 g，共6份，分别加入一定量的沉香四醇对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加标回收率实验结果

2.4.3 线性关系考察 将沉香四醇用乙醇稀释制成不同浓度的对照品溶液，进样测定，记录峰面积。以沉香四醇质量浓度(X，μg/ml)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=526.35 X+71.79(r=0.999 8)。结果表明，沉香四醇检测质量浓度线性范围为0.52～151 μg/ml。

2.4.4 定量限考察 精密量取“2.3.1”项下对照品，采用逐渐稀释对照品溶液的方法来确定定量限，结果表明，沉香四醇的定量限为0.50 ng/ml，证明此方法具有较好的灵敏度。

2.4.5 定量限考察 精密量取“2.3.1”项下对照品，采用逐渐稀释对照品溶液的方法来确定定量限，结果表明，沉香四醇的定量限为0.50 ng/ml，证明此方法具有较好的灵敏度，供试品溶液(洁白胶囊，批号:21154)色谱图见图2。

图2 多反应监测模式下洁白胶囊(批号:21154)中沉香四醇UPLC-MS/MS色谱图

2.5 样品中沉香四醇含量测定 取50批样品各适量，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 洁白胶囊(丸)中沉香四醇含量测定(n=50)

3 结论

沉香作为药物记载最早见于《名医别录》[9]，并列为上品，其中记载:“沉香、薰陆香、鸡舌香、藿香、詹糖香、枫香并微温。疗风水毒肿，去恶气”[10]。《本草纲目》[11]对沉香的功效应用也有全面的记载，《中国药典》2015年版收载的沉香功效为行气止痛，温中止呕，纳气平喘，主治胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急，沉香在洁白胶囊(丸)处方中虽然用量不大，却是重要的一味药。

洁白胶囊(丸)现行标准中尚无对沉香的检验项目，不少企业以次充好，使用劣质沉香或以山沉香代替沉香投料，直接影响了洁白胶囊(丸)的药效和临床疗效。本实验通过对不同厂家洁白胶囊(丸)中沉香四醇含量测定，发现不同企业、相同企业不同批号间沉香四醇含量差异较大，提示沉香药材质量不稳定;某企业洁白胶囊中沉香四醇的含量相对偏低，提示沉香药材质量较差;三批洁白丸中未检出沉香四醇，结合对企业的前期调研，提示可能存在用山沉香替代沉香投料的情况。该方法选择性强，灵敏度高，可用于测定洁白胶囊(丸)中沉香四醇含量，检测洁白胶囊(丸)中沉香使用情况，确保洁白胶囊(丸)质量可控。