二甲双胍通过PI3K-AKT-MDm2通路对PCOS患者子宫内膜的影响

邵 洋，杨婷婷，张 洁，强 萍

0 引言

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄妇女月经紊乱和不孕的最常见病因，临床表现为持续无排卵、雄激素过多、胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)[1]。调节PCOS激素内分泌紊乱是临床上主要的治疗原则。达英-35含醋酸环丙孕酮，可以抑制雄激素分泌与合成，临床上常用于PCOS治疗[2]。IR的调节在PCOS 治疗过程中的作用越来越受到重视[3]，盐酸二甲双胍是临床上常用的抗糖尿病药物，可以增加组织细胞对胰岛素的敏感性，临床上盐酸二甲双胍联合达英-35治疗PCOS的报道较多[4-5]，本研究观察了盐酸二甲双胍联合达英-35治疗PCOS对患者子宫内膜的影响，并探讨了PI3K-AKT-MDm2通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 病例资料 收集2016年2月至2019年1月我院诊治的86例PCOS患者，PCOS诊断参照《中国PCOS诊断标准(2011年)》[6]。排除对象:伴发糖尿病、先天性肾上腺皮质增生、肝脏疾病或者恶性肿瘤者，曾服用影响胰岛素敏感性或者激素类药物者。使用数字法将患者随机分为达英-35治疗组(对照组)和二甲双胍+达英-35治疗组(观察组)，每组43例。对照组年龄18～37岁，平均(28.16±5.24)岁，病程 11～46个月，平均(22.18±5.63)个月，月经初潮年龄12～15岁，平均(13.32±1.02)岁;观察组年龄20～40岁，平均(28.42±5.35)岁，病程 10～45个月，平均(22.33±5.71)个月，月经初潮年龄11～15岁，平均(13.18±1.14)岁。两组患者在年龄构成、病程长度、月经初潮年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另外，选择我院16例非PCOS患者正常子宫内膜组织(输卵管因素不孕经前或卵巢良性肿瘤术前行诊刮术者)作为非PCOS对照组，年龄20～39岁，平均(28.25±5.14)岁，月经初潮年龄12～16岁，平均(13.58±1.09)岁。PCOS患者与非PCOS对照组在年龄构成和月经初潮年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究所有患者均通过我院伦理委员会审核，所有受试者均知晓本研究并签署知情同意书。

1.2 治疗方法 对照组:于月经第5天起服用达英-35(德国先灵药业，醋酸环丙孕酮2 mg、炔雌醇0.035 mg)1片/d，连服21 d为1个疗程，共3个疗程。观察组:达英-35用药同对照组，同时，餐前0.5 h嚼服二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，0.5 g)，250 mg/次，2次/d，连用3个疗程。

1.3 临床观察指标 抽取PCOS患者静脉血，交由检验科，使用电化学发光法测定治疗前和疗程结束后的卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)，使用葡萄糖氧化酶法测定空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBG)，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)。检测试剂盒购自美国Sigma-aldrich公司。计算治疗前后PCOS患者体重指数(BMI，kg/m2)。采用阴道超声(TVB)测量治疗前后PCOS患者卵巢体积以及子宫内膜厚度。

1.4 子宫内膜的免疫组化染色检测 于闭经或阴道淋漓出血时行诊刮取PCOS患者子宫内膜组织，福尔马林固定后送病理科，石蜡包埋制作4 μm 组织样本切片，PI3K、p-AKT、AKT、MDm2抗体购自美国cell signal公司，严格按照抗体说明书操作加入相关抗体(1∶100稀释)，湿盒孵育过夜，加入生物素辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，显示剂反应显示后苏木精复染。整个操作使用全自动IHC平台Leica Bond-Max完成，棕色为阳性染色，染色评分=面积分数(阳性染色细胞比例)×染色强度(1=低强度，2=中强度，3=高强度染色)。

1.5 统计分析 使用SPSS 17.0统计软件处理数据，计量资料同个体治疗前后比较采用配对t检验，计量资料组间两两比较采用独立t检验，多组均数的比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组PCOS患者治疗前后临床指标的变化 治疗前，两组PCOS患者FSH、LH、T、HOMA-IR和BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，两组FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI水平降低(P<0.05，P<0.01)，且观察组低于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2 两组PCOS患者卵巢和子宫内膜的变化 治疗前，两组PCOS患者左右侧卵巢体积和子宫内膜厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，两组左右侧卵巢体积和子宫内膜厚度均显著减小(P<0.01)，且观察组小于对照组(P<0.05)，见表2。

2.3 二甲双胍对PCOS患者子宫内膜PI3K-AKT-MDm2的影响 PCOS患者子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色评分显著高于非PCOS对照组(P<0.05，P<0.01)，对照组子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色评分显著高于观察组(P<0.01)，见表3、图1。

表1 两组患者治疗前后临床指标比较

注:与治疗前比较，*P<0.05，**P<0.01;与对照组比较，#P<0.05

3 讨论

PCOS在育龄期女性中的患病率为7%～10%，患者以排卵功能障碍、多囊卵巢和高雄激素血症为特征[7]，患者无法产生孕激素来平衡雌激素，在雌激素长期作用下，患者的子宫内膜受到影响，增生过多，甚至癌变[8]。有报道，40岁以下子宫内膜癌患者中约19%～25%伴发PCOS[9-10]。达英-35是炔雌醇和雄激素受体拮抗剂醋酸环丙孕酮组成的复方制剂，可以调节PCOS患者的激素异常，是临床上首选治疗药物。然而，有研究显示，单独达英-35治疗效果并不理想[11]。实验结果显示，胰岛素抵抗在PCOS患者激素紊乱中的作用逐渐被发现[12-14]，因此，胰岛素增敏剂开始受到临床工作者的关注。二甲双胍是常用的抗糖尿病药物，可以增加组织细胞对胰岛素的敏感性[15-16]。本研究显示，治疗后，观察组患者FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI均低于对照组，说明加用二甲双胍拮抗胰岛素抵抗后，患者的激素紊乱得到了有效纠正。进一步的卵巢体积和子宫内膜厚度检查发现，治疗后，观察组卵巢体积和子宫内膜厚度均小于对照组，表明拮抗胰岛素抵抗更有利于患者卵巢和子宫内膜的恢复。

表2 两组患者治疗前后卵巢体积和子宫内膜厚度比较

注:与治疗前比较，**P<0.01;与对照组比较，#P<0.05

表3 三组患者子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色评分比较

注:与治疗前比较，**P<0.01;与对照组比较，##P<0.01

图1 三组患者子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白的免疫组化染色(200×)

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路是机体内细胞增殖的重要通路，PI3K由催化亚基pl10 和抑制性调节亚基p85组成，生长信号激活时，2个亚基分离，激活亚基pl10的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，进一步磷酸化下游的Akt[17]。PI3K/Akt通路在孕妇的胰岛素抵抗以及子宫内膜的增殖中发挥重要作用[18]。双微体(Murine double minute2，MDm2)基因是PI3K/Akt下游的靶基因，MDm2的靶基因是P53，PI3K/AKT通路活化，会导致MDm2表达升高，引起p53快速降解，引起细胞的异常增殖[19]，因此，PI3K-AKT-MDm2通路在子宫内膜增殖以及子宫内膜癌的发生发展中都发挥了积极的作用。本研究以正常子宫内膜作为对照，发现PCOS患者子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表达显著升高，表明 PCOS患者子宫内膜存在PI3K-AKT-MDm2通路的过度激活;观察组PCOS患者子宫内膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表达显著低于对照组，表明二甲双胍可以抑制PCOS患者PI3K-AKT-MDm2通路的激活，这可能是二甲双胍抑制PCOS患者子宫内膜增殖的机制[20]。苏椿淋等[21]研究显示，达英-35联合二甲双胍治疗PCOS合并子宫内膜不典型增生及早期子宫内膜样腺癌，可以使患者子宫内膜病变完全转化，二甲双胍治疗是否可以降低PCOS子宫内膜癌的发生率有待长期随访来揭示。

综上所述，本研究显示，二甲双胍通过抑制PCOS患者子宫内膜PI3K-AKT-MDm2通路，抑制子宫内膜的增殖。