冠脉介入术后患者血清miR-146a的表达及其与阿司匹林抵抗的关系

朱 弢,郑伟青,王 斌,林江波,金顺巧,江建军*

0 引言

血小板在冠状动脉疾病的发病机制中起着重要的作用[1]。血小板的激活和聚集参与了动脉粥样硬化斑块破裂和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)导致的冠状动脉机械破裂之后的冠状动脉内血栓增殖过程[1-2]。抗血小板治疗是冠状动脉疾病的标准疗法。Meta分析显示，在接受抗血小板治疗的高危冠心病患者中，严重血管事件的复发率降低了25%[1]。阿司匹林主要抗栓机制是乙酰化血小板中的环氧化酶-1(COX-1)，从而抑制血栓素的合成。然而，有部分患者在服用阿司匹林后未观察到相同的抗血小板作用，反而出现复发性血栓栓塞，这种现象称为阿司匹林抵抗(AR)。贫血、高龄、糖尿病、高三酰甘油以及高血压是冠心病患者发生AR的危险因素。然而，关于miR-146a与冠心病患者PCI术后发生AR的研究十分有限。本研究旨在探讨冠心病患者血清miR-146a表达水平与PCI术后发生AR的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年11 月至2018年8月在我院心内科接受PCI治疗的冠心病患者。纳入标准:①经确诊为冠心病，且接受PCI 治疗;②年龄≤80 岁;③无手术禁忌证;④入院前未接受阿司匹林治疗。排除标准:①对阿司匹林过敏者;②合并出血性疾病、血液系统疾病或有出血倾向者;③术前2周口服抗凝药(如噻氯匹定、华法林、替格瑞洛等)者;④合并恶性肿瘤、心功能Ⅳ级、严重感染、严重肝肾功能损害等其他严重疾病者。本研究经我院伦理委员会批准，所有研究对象在参与本研究前均已签署知情同意书。

1.2 抗凝治疗方法 PCI术后，所有患者给予口服阿司匹林(批号:J20171021，拜耳医药保健有限公司)治疗，0.1 g/次，1次/d，持续治疗30 d。

1.3 AR诊断标准 根据Gum定义的AR标准，同时满足以下2个条件者为AR，满足二者之一者为阿司匹林半抵抗(ASR):①用10 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)作为诱导剂，测得血液中的血小板平均聚集率≥70%;②用0.5 mg/ml花生四烯酸(AA)作为诱导剂，测得血液中的血小板平均聚集率≥20%。AR和ASR统称为AR[3]。

1.4 血清miR-146a的检测 于术前抽取患者空腹静脉血5 ml，3 000 r/min离心取上清液。采用Trizol试剂盒(Invitogen，Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。所得RNA样品的质量经琼脂糖凝胶电泳证实。凝胶显示清晰的28 S、18 S和5 S带，28 S带的亮度约为18 S的2倍，表明RNA是完整的，可用于后续实验。用逆转录试剂盒产生cDNA。采用聚合酶链反应(RT-PCR)，以β-肌动蛋白为内参照基因，测量miR-146a的表达水平。RT-PCR条件包括35个循环:95 ℃变性30 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s。每个RT-PCR实验至少重复3次取平均值。采用2-△△CT法计算miR-146a相对表达量。

2 结果

2.1 研究对象一般情况 本研究共纳入376例患者，男267例(71.01%)，女109例(28.99%)。平均年龄(62.70±8.6)岁，63 例(16.76%)为AR患者。对患者一般资料进行比较，AR组中吸烟、高血压、糖尿病的构成比显著高于非AR组，AR组空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和miR-146a表达水平显著高于非AR组，AR组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著低于非AR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 两组研究对象一般情况比较

2.2 血小板平均聚集率与各指标之间的相关性分析 对376例患者ADP诱导的血小板平均聚集率和AA诱导的血小板平均聚集率与其他指标进行Pearson直线相关分析。结果显示，ADP诱导的血小板平均聚集率和AA诱导的血小板平均聚集率均与血糖、三酰甘油、LDL-C和miR-146a呈正相关(P<0.05)，与HDL-C呈负相关(P<0.05)，而与年龄、总胆固醇和血小板计数无关(P>0.05)，结果见表2。

2.3 ROC曲线分析 当miR-146a的cut-off值为4.17时，预测冠心病患者PCI术后发生AR的敏感度为93.2%，特异度为62.6%，曲线下面积为0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。结果见图1。

2.4 多因素Logistic回归分析 以测冠心病患者PCI术后发生AR为因变量，以表1中两组差异有统计学意义的变量(吸烟、高血压、糖尿病、血糖、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、miR-146a)为自变量纳入Logistic回归方程，采用后退法。结果显示,吸烟、高血压、糖尿病、高血糖、高三酰甘油、低HDL-C、高LDL-C、高miR-146a是冠心病患者PCI术后发生AR的独立危险因素(P<0.05)。结果见表3。

图1 miR-146a预测冠心病患者PCI术后发生AR的ROC曲线

3 讨论

PCI是冠心病患者最常用的治疗方式。PCI主要通过冠状动脉支架的植入从而实现血运重建的目的，目前已被广泛应用于临床[4]。近年研究显示，支架本身可以激活血小板，引起支架内血小板聚集，导致支架内血栓形成，进而严重危及患者的生命安全[5]。目前，阿司匹林常用于冠心病患者PCI术后抗血小板治疗且效果显著。然而在治疗的过程中，部分患者血小板活性并没有被完全抑制，会出现阿司匹林抵抗，从而导致不良的临床效果[6-7]。本研究检测了376例经皮冠状动脉介入治疗冠心病患者的血小板聚集率。结果表明，AR的发生率为16.8%，与文献报道一致[8]。

表2 血小板平均聚集率与各指标之间的相关性分析

表3 冠心病患者PCI术后发生AR多因素Logistic回归分析

microRNA是短的非编码RNA，在转录水平上抑制蛋白编码基因的表达[9]。每一个microRNA可调节几十到数百个与功能相关的靶基因。随着对microRNA研究的不断深入，越来越多的研究发现，microRNA与阿司匹林抵抗有一定的相关性。范雪松等[10]的研究发现，较低水平的尿miR-126与健康人AR发生风险增加显著相关。王建丽[11]研究发现，血小板miR-200b和miR-495表达水平降低可增加急性脑梗死患者AR的发生风险。马开富等[12]检测了137例急性脑梗死患者血小板miR-19a的表达水平， 发现AR组患者血小板miR-19a的表达水平显著高于非AR组患者。然而，尚没有研究探索miR-146a与冠心病患者PCI术后发生AR的相关性。本研究纳入在我院心内科接受PCI治疗的冠心病患者376例，检测其血清miR-146a的表达水平，并分析血清miR-146a的表达水平与AR的相关性，结果发现，miR-146a的表达水平上调可增加冠心病患者PCI术后发生AR的风险。目前，AR的发生机制尚不清楚，有学者认为关于其可能与非COX-1介导的血小板活化、药代动力学、血小板反应性、药物遗传学等有关。王路桥等[13]的研究发现，miR-146a可能依赖血小板TLR-4信号通路，介导血小板免疫活化进而促进血小板聚集。Guo等[14]研究发现，miR-146a可促进Th1细胞的上调并促进炎症反应，而炎症反应又可促进AR的发生发展[15]。

此外，本研究采用ROC曲线计算了miR-146a对冠心病患者PCI术后发生AR的预测价值。结果发现，敏感度为93.2%，特异度为62.6%，曲线下面积为0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。进一步证实了miR-146a对冠心病患者PCI术后发生AR具有一定的预测价值。

综上所述，本研究发现血清miR-146a表达水平与冠心病患者PCI术后发生AR显著相关，miR-146a表达水平上调可增加冠心病患者PCI术后发生AR的风险。