基于理性设计提高产微球茎菌AG1琼胶酶的热稳定性

郭玉淅 高 贺 倪 辉 ，2，3，4 姜泽东 ，2，3，4 肖安风 ，2，3，4 朱艳冰 ，2，3，4*

（1 集美大学食品与生物工程学院 福建厦门 361021

2 福建省食品微生物与酶工程重点实验室 福建厦门 361021

3 厦门市食品与生物工程技术研究中心 福建厦门 361021

4 厦门市南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室 福建厦门 361021）

琼胶又称琼脂，是江蓠、紫菜和石花菜等红藻的细胞壁的亲水性多糖，由琼脂糖和琼脂胶组成[1]。琼脂糖是一种由D-半乳糖和3，6-内醚-α-L-半乳糖经 α（1→3）和 β（1→4）糖苷键交替连接而成的链状多糖，是形成凝胶的主要组分。琼脂胶是一种非凝胶组分，具有与琼脂糖类似的多糖链状结构，含有多种取代基，如硫酸酯、丙酮酸乙缩醛、甲基等。琼胶酶能催化水解琼脂糖分子内的糖苷键，产生琼胶寡糖。基于所催化糖苷键的类型差异，琼胶酶分为两大类：α-琼胶酶（E.C.3.2.1.158）和β-琼胶酶（E.C.3.2.1.81），前者作用于琼脂糖的α-1，3 糖苷键，产物是以 3，6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖；后者作用于琼脂糖的β-1，4糖苷键，产物是以D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖[2-3]。琼胶寡糖水溶性好，易于为人体吸收，具有多种生理功能，如抑菌、抗氧化、抗癌、美白、保湿、益生元等[4-7]。琼胶酶作为一种重要的工具酶，可以制备琼胶寡糖，用于海藻多糖结构研究，水解琼脂糖凝胶并从中回收DNA和RNA，以及制备海藻单细胞和原生质体，被广泛应用于食品、制药和日用化工等领域。

琼胶酶主要存在于海洋微生物和一些海洋软体动物的消化道内[8]。琼脂的热溶液在43℃以下就能凝固形成凝胶[9]。琼脂溶液具有较高的黏度，其随着温度的降低逐渐增加。研究具有良好热稳定性的琼胶酶，对于琼胶的利用具有重要意义。

在先前的研究中，从产微球茎菌AG1（Microbulbifer sp.AG1）中克隆得到琼胶酶基因[10]，它的GenBank登录号为KU049031。为获得热稳定性高的琼胶酶，本文采用理性设计方法获得琼胶酶突变体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 含菌株AG1琼胶酶基因的重组质粒和大肠杆菌（E.coli）BL21由实验室保存；原核表达载体pGEX-6P-1为Novagen产品。

1.1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶BamHI和XhoI，为TaKaRa公司产品；T4DNA连接酶，Fermentas公司产品；柱式DNA胶回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒，购买自天根生化科技（北京）有限公司；寡核苷酸引物的合成及核酸序列的测定均由华大基因（上海）股份有限公司完成；Glutathione sepharose 4B，GE Healthcare Life Sciences公司产品；琼脂糖，购于美国Hydragene公司；其余化学试剂均为国产分析纯产品。

1.1.3 主要仪器与设备 ZHWY-2102双层全温度恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；Mastercycler gradient PCR仪，德国Eppendorf公司；5810R冷冻离心机，德国Eppendorf公司；UV-5200紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；XMTD-8222数显恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提高产微球茎菌AG1琼胶酶热稳定性位点的选取 使用PoPMuSiC-2.1在线分析工具[11]（http：//dezyme.com/）分析菌株AG1琼胶酶序列，在线计算琼胶酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化，选择去折叠自由能显著减少的氨基酸作为突变位点。经分析选择D136N作为突变位点，设计扩增D136N基因的引物，序列如表1所示。

表1 突变体D136N的特异性引物Table1 The specific primers for mutant D136N

1.2.2 突变体D136N基因的获得 采用重叠延伸PCR获得突变体基因。分别以P1和P4、P2和P3为引物，以含有琼胶酶基因的重组质粒为模板，进行PCR，条件为95℃5 min预变性；94℃45 s，50℃45 s，72℃60 s，30 个循环；72℃延伸5 min，回收并纯化PCR产物。取上述两轮PCR纯化产物，加入引物P1和P2扩增全基因片断。最后回收并纯化PCR产物，获得突变体基因。

1.2.3 含突变体D136N基因重组质粒的构建 将突变基因和质粒PGEX-6P-1分别进行BamHI和XhoI的双酶切反应，酶切后的基因片段和表达载体进行连接反应后，转化至E.coli BL21感受态细胞，将其涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基。37℃过夜培养，选取菌落PCR阳性的克隆子，并进行测序，确认插入序列。

1.2.4 突变琼胶酶在大肠杆菌（E.coli）中的诱导表达与纯化 将含有突变体基因的阳性克隆单菌落37℃过夜培养，转接培养至OD600为0.8，加入IPTG至终浓度0.05 mmol/L，22℃诱导表达16 h后，4℃、5 000×g离心 20 min，弃上清，菌体用预冷的PBS缓冲液 （140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH 7.3）重悬，在冰浴条件下超声破菌后，4℃、12 000×g离心20 min，获得的上清液即粗酶液。参照Glutathione sepharose 4B的使用说明书，采用亲和层析纯化重组蛋白。蛋白质的纯度及分子质量利用SDS-PAGE分析。利用BCA蛋白定量法进行蛋白质浓度测定。

1.2.5 琼胶酶活力的测定 酶活力测定采用DNS法[12]。取580 μL含 0.3%琼脂糖的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），加入 20 μL 琼胶酶（质量浓度为0.5 mg/mL），60℃反应30 min后，沸水浴10 min终止反应。加入900 μL DNS试剂，混匀后沸水浴10 min，冷却后加蒸馏水定容至5 mL，于540 nm波长下测定吸光值。琼胶酶活力定义为，在上述条件下，每分钟能够水解底物释放1 μmoL还原糖（以D-半乳糖计）所需的酶量。

1.2.6 温度对琼胶酶的影响 分别在不同温度（30，40，50，60，70和 80℃）下检测酶的活力，并以最高酶活力为100%，研究酶的最适反应温度。将酶分别置于不同温度（40，50，60和70℃）下分别放置10～60 min后，测定酶的残余活力，以未经处理的酶活力为100%，研究酶的热稳定性。

1.2.7 pH对琼胶酶的影响 分别用不同pH缓冲液配置0.3%的琼脂糖底物溶液，并测定酶的活力，以最高酶活力为100%，研究酶的最适反应pH。所用的缓冲液为50 mmol/L C6H8O7-Na2HPO4缓冲液（pH 4.0～7.0），50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.0～9.0），50 mmol/L 甘氨酸-NaOH 缓冲液（pH 9.0～10.0）。将酶分别置于不同pH的缓冲液中，25℃放置1 h后，测定酶的残余活力，以未经处理的酶活力为100%，研究酶的pH稳定性。

1.2.8 动力学参数的测定 分别配制不同浓度的琼脂糖溶液 （0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.6和 0.8 mg/mL），测定酶在不同底物浓度下的酶活力。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算酶的动力学参数，包括 Km，Vmax，kcat和 kcat/Km。

1.2.9 酶的结构分析 利用SWISS-MODEL进行琼脂酶的三维模建，使用PyMOL软件显示并分析酶的结构。

2 结果

2.1 温度对突变体D136N活性及稳定性的影响

在不同温度下测定酶的活力，结果（图1）显示，突变体D136N与野生型同样在60℃下表现出最大活力。突变酶在40～70℃的温度范围内呈现70%以上的相对活力，与野生型相比，突变体D136N在较低温度下表现出更高的酶活力。

酶的热稳定性分析结果见图2。突变体D136N在40，50和60℃热处理1 h后还能保持相对稳定，能够保持超过85%的活力。野生型在50和60℃处理1 h，能分别保持约66%和19%的相对酶活力。突变酶与野生型在70℃下温育10 min都基本失去活力。这些结果表明，突变体D136N相比野生型琼胶酶具有更好的热稳定性。

图1 突变体D136N和野生型琼胶酶的最适作用温度Fig.1 The optimum temperature of the mutant D136N and wild-type agarase

图2 温度对突变体D136N和野生型琼胶酶热稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on the thermostability of the mutant D136N and wild-type agarase

2.2 pH对突变体D136N活性及稳定性的影响

突变体D136N与野生型酶的最适反应pH均为7.5（图3a）。突变酶在pH 6.0～9.0之间保持了较高的活力，具有最高活力的60%以上，在pH 4.0和10.0条件下，酶活力基本丧失。pH稳定性分析结果（图3b）显示，与野生型酶相似，突变体D136N在pH 6.0～9.0范围内具有良好的稳定性，25℃处理1 h后仍能够保持高于80%的活力，但是在pH 10.0的条件下处理后酶稳定性迅速下降。

图3 pH对突变体D136N和野生型琼胶酶的活性（a）和稳定性（b）的影响Fig.3 Effect of pH on the activity （a） and thermostability （b） of the mutant D136N and wild-type agarase

2.3 突变体D136N的动力学参数

以琼脂糖为底物测定酶的动力学参数。结果如表2所示，与野生型相比，突变体D136N的Km值和kcat值增大，Vmax值略微增加，kcat/Km值降低。说明突变体D136N对琼脂糖的亲和能力下降，催化效率也有所降低。

表2 野生型和突变体D136N的动力学参数Table2 Kinetic parameters for wild-type enzyme and mutant enzyme of D136N

2.4 琼胶酶的结构分析

酶的结构分析显示，野生型琼胶酶的Asp136与Asn255形成两个氢键，与Tyr282形成一个氢键（图4a）。突变后的Asn136和Asn255形成3个氢键，与Tyr282形成一个氢键，还与Ala134形成一个氢键（图4b）。因此突变后的136位氨基酸能够与周围氨基酸形成更多的氢键。

图4 突变位点引起的氢键变化Fig.4 Hydrogen bonds changes caused by the mutant site

3 讨论

蛋白质的理性设计是在对蛋白质结构与功能认识的基础上，采用定点突变技术改变蛋白质中的个别氨基酸残基，使蛋白质的性质向着既定的方向改变[13-14]。本文基于理性设计，采用重叠延伸PCR技术，通过将Asp136突变为Asn136，获得热稳定性预计提高的突变体D136N。

将突变体D136N进行诱导表达和纯化，得到突变琼胶酶，并对其酶学性质进行研究。与野生型酶相比，突变体D136N对琼脂糖的亲和能力下降，催化效率也有所降低。突变酶的最适反应温度和最适反应pH与野生型相同。突变体D136N在pH 6.0～9.0范围内稳定，在 40，50和 60℃，该突变酶的热稳定性好于野生型酶。这些性质提高了该突变酶在工业应用上的价值，使其在实际生产应用中具有良好前景。

蛋白质的热稳定性与带电荷残基、疏水氨基酸残基、盐键、氢键、疏水相互作用等因素有关[15-18]。氢键是通过氢原子参与成键的特殊形式的化学键，是维持蛋白质结构的主要作用力之一。Zhu等[19]和Zhou等[20]通过定向进化获得了热稳定性的酶，对于这些酶突变位点的微观结构分析发现，突变体相较于野生型在突变位点附近都产生了新的氢键。本文中，相较于野生型酶，突变体D136N在136位的氨基酸形成的氢键增加2个。增加的氢键可能更有利于维持产微球茎菌AG1琼胶酶的结构，使其具有更好的热稳定性。