莲子壳多酚的抗氧化活性和稳定性

颜 征 张海晖 李亚群 段玉清* 陆玉洪 孙冀平

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江 212013

2 江苏怡味莲朗伯食品有限公司 江苏宝应 225800）

莲子壳是睡莲科植物莲种子的壳，莲子壳作为莲子加工的副产物，通常被焚烧而未被充分利用，造成资源浪费。有文献报道新鲜莲子壳富含单宁、黄酮[1]、花青素[2]等多酚类物质，具有很高的利用价值。植物多酚又称植物单宁或鞣质，是一种植物体内多元酚类次生代谢物，广泛存在于植物的皮、根、叶和果实中[3]。植物多酚具有良好的抗氧化、抑菌、抗肿瘤等生物活性[4-8]。亚临界水是介于其沸点和临界温度（100～374℃）之间，维持在适当压力下的水[9]。常温常压下，水的极性较强，在亚临界条件下，随着温度的升高，水的氢键被打开或减弱，对中性或非极性有机物的溶解能力也会增加[10]，从而可以连续提取天然产物中的水溶性成分和脂溶性成分。亚临界水对多糖类、皂甙类、黄酮类大分子化合物的提取效果较优[11]。亚临界水萃取技术以价廉、无污染的水作为溶剂，被视为绿色环保、前景广阔的一项变革性技术[12]。本文采用亚临界水萃取技术和大孔树脂联用制备莲子壳多酚，并对多酚的抗氧化活性和储藏稳定性进行研究，以期提高莲子壳多酚的利用率，为后期产品开发提供理论基础[13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜莲子壳购于江苏省镇江市农贸市场。AB-8型大孔树脂购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司。没食子酸、福林-酚试剂、亚硫酸氢钠、无水碳酸钠、三氯化铁、DPPH、ABTS、VC、乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SGH型亚临界水反应釜，镇江丹徒环球机电配件厂生产；UV-1601紫外-可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；ALPHAI-4/2-4冷冻干燥机，德国CHRIST公司；DL-5C离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-9015A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；JA2003分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；GFB型中药粉碎机，上海一恒科学仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅，江苏金坛市医疗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 莲子壳多酚的制备 将莲子壳烘干后粉碎，过100目筛。称取一定量的莲子壳粉末，按水料比 30∶1（mL/g）加入萃取釜中，并加入溶剂量1‰的NaHSO3作为辅助萃取剂，控制萃取温度160℃下萃取15 min。将萃取液经4 000 r/min离心8 min，并抽滤得到莲子壳多酚粗提液，粗提液过AB-8大孔吸附树脂柱分离/富集，用体积分数70%乙醇水溶液洗脱（流速2 mL/min），收集洗脱液，45℃下减压浓缩，将浓缩液真空冷冻干燥，即为莲子壳多酚粉末。

1.3.2 多酚含量的测定 采用福林-酚法[14]稍作修改。取一定体积的Folin试剂稀释10倍，取该稀释液4 mL加入到1 mL样液中，然后加入7.5%的碳酸钠溶液5 mL，25℃静置2 h后，于765 nm测定吸光度。以没食子酸为标准物质，配成浓度梯度为 12.5，25，50，100，150，200μg/mL 的样液，建立标准曲线，求得没食子酸浓度与吸光度的回归方程。

1.3.3 莲子壳多酚的抗氧化性测定

1.3.3.1 还原能力测定 还原能力测定，参照李金凤等[15]的方法。取25～200 μg/mL的莲子壳多酚样品1 mL分别加入pH值为6.6的磷酸盐缓冲液2.5 mL和10 mg/mL的铁氰化钾溶液2.5 mL，摇匀，50℃保温20 min后取出，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀后于700 nm处测定吸光度。以不加多酚样品为空白对照。与VC比较。吸光度越大，表明样品还原能力越强。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力测定 参照Choe等[16]的方法。将莲子壳多酚样品配成25～200 μg/mL的溶液（无水乙醇配制），取2 mL于试管中，加入 2 mL DPPH·无水乙醇溶液（200 μmol/L）。混匀后在室温下避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度，记为Ax。空白组：2 mL无水乙醇和2 mL多酚样品溶液（不同浓度）；对照组：2 mL的DPPH·溶液和2 mL无水乙醇，在517 nm波长下测定吸光度，记为Ao。与VC比较。DPPH·清除率的计算见公式（1）：

1.3.3.3 ABTS自由基清除能力测定 参照Akkarih等[17]的方法，稍作改进。

（1） ABTS+·溶液的配制：7 mmol/L ABTS 溶液与 4.9 mmol/L过硫酸钾溶液以 1∶1（V/V）充分混匀，室温避光放置 12～16 h（避光），形成 ABTS+·储备液，备用。使用时稀释，使得稀释液734 nm处的吸光值0.7±0.02，现用现配。

（2）试验方法：用无水乙醇配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液，各取200 μL于试管中，加入4 mL的ABTS+·溶液，充分振摇30 s，室温下反应6 min（避光），于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Ai。对照管：200 μL无水乙醇和4 mL ABTS+·溶液，于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Ao；标准管：200 μL样液和4 mL无水乙醇，于724 nm处测定反应后样液的吸光值，记为Aj。与VC比较。ABTS+·清除率的计算见公式（2）：

1.3.3.4 O·2-清除能力测定 参照Zhang等[18]的方法，稍作改进。配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液。取4.5 mL Tris-Hcl缓冲液于10 mL具塞比色管中，在20℃水浴预热20 min后，分别加入不同浓度的多酚样品溶液1 mL和25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，摇匀后用蒸馏水稀释至刻度。置于25℃水浴反应5 min，取出后立即加入8 mol/L HCl溶液1 mL，终止反应。于299 nm处的吸光度Ai。空白以蒸馏水代替样品溶液，测定吸光度Ao；考虑到样品液本底的影响，同时测定不加邻苯三酚溶液的相同浓度的样品溶液的吸光度Aj，并与VC做比较。O·2-清除率的计算见公式（3）：

1.3.3.5 NO2-清除能力测定 参照龚明贵等[19]的方法。配制质量浓度分别为25～200 μg/mL的莲子壳多酚样液。准确吸取5 mg/L的NaNO2溶液2 mL置于25 mL比色管中，分别加入2 mL不同浓度的多酚样品溶液，25℃下水浴30 min，取出后立即加入1 mL对氨基苯磺酸溶液（4 g/L），摇匀后于25℃下水浴5 min，再分别加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L），用蒸馏水定容至刻度，摇匀，于25℃水浴15 min后于538 nm处测定吸光度。以蒸馏水为参比，并于VC比较。NO2-清除率的计算见公式（4）：

式中：Ao——空白对照液的吸光度；Ax——加入样品后的吸光度；Axo——样品本底的吸光度。

1.3.4 莲子壳多酚的稳定性研究

1.3.4.1 pH值对莲子壳多酚稳定性的影响 用1 mol/L的盐酸和1 mol/L的氢氧化钠配成pH分别为 2，4，6，8，10，12 的溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。

1.3.4.2 光照对莲子壳多酚稳定性的影响 配制一定浓度的多酚水溶液，摇匀，将其分别放置于避光和自然光的条件下，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm波长下测其吸光度。

1.3.4.3 温度对莲子壳多酚稳定性的影响 配制一定浓度的多酚水溶液，摇匀，将其分别放置于37℃、室温（25℃）、4℃的条件下，每隔3 d取样1 mL，并稀释3倍，在280 nm波长下测其吸光度。

1.3.4.4 食盐对莲子壳多酚稳定性的影响 配制浓度分别为0.02，0.04，0.06 g/mL的食盐溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。以蒸馏水加入适量多酚样品作为对照。

1.3.4.5 糖对莲子壳多酚稳定性的影响 配制质量浓度为0.1 g/mL的葡萄糖溶液和0.1 g/mL的蔗糖溶液，加入适量多酚样品，每隔3 d取样1 mL，并稀释4倍，在280 nm下测其吸光度。以蒸馏水加入适量多酚样品作为对照。

2 结果与分析

2.1 总多酚测定标准曲线和多酚含量

通过没食子酸浓度和吸光度建立标准曲线，得到回归方程为：y=0.005 x-0.0274，R2=0.992，表明没食子酸浓度与吸光度间具有良好的线性关系。通过该方程，求得莲子壳多酚粉末得率为4.03%，其粉末中多酚纯度为99.50%。

2.2 莲子壳多酚的抗氧化性

2.2.1 莲子壳多酚的还原能力 抗氧化物在酸性条件下，将Fe3+还原成显蓝色的Fe2+，测定其吸光度，就能得到被测液体的还原力[20]。由图1可知，莲子壳多酚和VC均有较强的还原能力，且随样品浓度增大，吸光度不断增大，说明样品质量浓度越高，还原能力越强。

2.2.2 莲子壳多酚清除DPPH自由基的能力 当溶液中存在抗氧化剂时，抗氧化剂能够给DPPH自由基提供氢原子和电子使其发生褪色，吸光值变小，其颜色变得越浅表明抗氧化剂的抗氧化能力越强[21]。从图2中可以得出，莲子壳多酚和VC均有较好的清除DPPH自由基效果。随着样品溶液浓度增大，DPPH自由基清除率增大，当样品溶液质量浓度为100 μg/mL时，莲子壳多酚对DPPH自由基的清除率达到95.45%。

图1 莲子壳多酚的还原能力Fig.1 Reducing power of polyphenols in lotus seeds hull

2.2.3 莲子壳多酚清除ABTS+·的能力 抗氧化剂会将蓝绿色的ABTS+·还原成无色的ABTS，在734 nm波长处测定吸光度，吸光度变化越大，其清除能力越强[22]。莲子壳多酚和VC的清除ABTS+·能力如图3所示，随着样品浓度的增大，清除ABTS+·的能力增强。莲子壳多酚和VC均有较强的ABTS+·清除能力，当样品浓度低于100 μg/mL时，莲子壳多酚清除ABTS+·的能力强于VC；当样品质量浓度达到100 μg/mL以上时，莲子壳多酚和VC对ABTS+·的清除率均接近100%。

图2 莲子壳多酚清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH free radicals scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.4 莲子壳多酚清除O·2-的能力 超氧阴离子自由基是反应性氧中间物的一种，其与羟基结合后的产物会对细胞DNA造成损坏，清除超氧阴离子自由基在抗氧化过程中起着重要作用[23]。由图4可知，莲子壳多酚和VC对超氧阴离子均有一定的清除效果，且随样品浓度增大，清除能力增强。

图3 莲子壳多酚清除ABTS+ ·的能力Fig.3 ABTS+ ·scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

图4 莲子壳多酚清除O·2- 的能力Fig.4 O·2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

2.2.5 莲子壳多酚清除NO2-的能力 莲子壳多酚和VC对亚硝酸根离子的清除能力如图5所示，莲子壳多酚和VC对亚硝酸根离子均有较好的清除效果，随着样品浓度的增大，清除NO2-的能力增强。当样品溶液质量浓度为100 μg/mL时，莲子壳多酚对NO2-的清除率达到41.20%。

2.3 莲子壳多酚的稳定性

2.3.1 pH对莲子壳多酚稳定性的影响 由图6可知，在pH 2～6之间时，莲子壳多酚较稳定，吸光值变化较小；在pH 8～12条件下，莲子壳多酚吸光值变化较大，表明在碱性条件下莲子壳多酚不稳定。这是因为多酚富含酚羟基，在酸性或中性条件下，多酚性质较为稳定；在碱性条件下，破坏了多酚的结构，生成其它物质[24]，在pH为12时，尤其明显。因此，应在酸性条件下保存莲子壳多酚。

图5 莲子壳多酚清除NO2- 的能力Fig.5 NO2- scavenging ability of lotus seeds hull polyphenols

图6 pH对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.6 Effect of pH the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.2 光照对莲子壳多酚稳定性的影响 从图7可以看出，莲子壳多酚对光较敏感。在避光和自然光条件下，密封保存的0～3 d和9～15 d，莲子壳多酚的吸光度均略有增大，密封保存的3～9 d，莲子壳多酚的吸光度均略有减小，说明多酚类物质在贮存过程中可能发生部分聚合或降解，但两者具有相同趋势。

2.3.3 温度对莲子壳多酚稳定性的影响 由图8可以看出，在4℃条件下保存，莲子壳多酚溶液吸光值变化很小；在室温和37℃条件下，莲子壳多酚溶液吸光值均有明显变化，说明莲子壳多酚结构发生变化，高温下莲子壳结构发生变化，故应在低温条件下保存莲子壳多酚。

图7 光照对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.7 Effect of light on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

图8 温度对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.8 Effect of temperature on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.4 食盐对莲子壳多酚稳定性的影响 不同浓度食盐对莲子壳多酚稳定性的影响如图9所示，无食盐、0.02 g/mL食盐、0.04 g/mL食盐和0.06 g/mL食盐条件下，莲子壳多酚溶液吸光度变化相似，说明食盐既不会破坏莲子壳多酚，也不能保护莲子壳多酚。因此生产加工过程中，添加食盐不会影响莲子壳多酚的稳定性。

图9 食盐对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.9 Effect of salt on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

2.3.5 糖对莲子壳多酚稳定性的影响 由图10可以得出，在无糖条件下，莲子壳多酚吸光度变化较明显，在0.1 g/mL葡萄糖和蔗糖溶液中，莲子壳多酚吸光变化较小，说明莲子壳多酚比较稳定，葡萄糖和蔗糖对莲子壳多酚均有一定的保护作用。这是因为糖的添加降低了溶液水分活度，从而减少了多酚的破坏[25]。

图10 糖对莲子壳多酚稳定性的影响Fig.10 Effect of sugar on the stability of polyphenols from lotus seeds hull

3 结论

1）经亚临界水萃取和AB-8大孔吸附树脂联用制备莲子壳多酚，其得率为4.03%，多酚纯度为99.50%。

2） 莲子壳多酚对DPPH·、ABTS+·、O·2-、NO2-均有较好的清除效果。莲子壳多酚在4℃、避光、pH 2～6条件下储存较稳定，食盐对莲子壳多酚的稳定性没有影响，蔗糖和葡萄糖均对莲子壳多酚有一定的保护作用，可以为多酚产品的加工提供理论基础。