新型抗菌肽CAM a的制备及其在断奶仔猪生产中的应用

凌红丽，郭佳宏，夏 叶，蒋贻海，魏 波，缪德年*

（1青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛266001；2上海市农业科学院上海种猪工程技术研究中心，上海201106）

在畜禽生产中使用抗生素等兽药或饲料添加剂是保障畜禽健康和生产效益的有效措施，但长期使用会导致病原菌耐药、药物残留等重大问题。随着国内外禁止抗生素使用法规的出台，抗生素作为饲料添加剂必将退出历史舞台。研究开发新型抗菌剂代替抗生素成为当前畜牧兽医科技工作者的重要工作。抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP）又名抗微生物肽（Antimicrobial peptide，AMP），是一类由生物体产生的、具有多种生物活性的小分子多肽，具有代替抗生素的潜力［1］。但抗菌肽应用于临床还面临两大瓶颈问题，一是对病原菌的杀灭活性尚不够高，二是对真核生物细胞具有一定的毒性。因此，从这两方面进行改进完善是研究设计抗菌肽分子的焦点。人工研究设计的抗菌肽具有高效、广谱、低毒等优点，目前抗菌肽的研究设计重点在改变抗菌肽两性分子中α-螺旋的氨基酸组成，增强其螺旋度；将带电的氨基酸引入抗菌肽片段来增加其带电荷数，以得到活性更高、抗菌谱更广的抗菌肽［2-9］。

本试验通过互联网和计算机软件设计了具有良好抗菌活性的抗菌肽CAMa，并实现其在毕赤酵母中的高效表达，通过研究CAMa对猪生产性能及腹泻发病率的影响，以期为抗生素替代品的研究和应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

E.coliDH5α感受态细胞由本实验室制备并保存。Zeocin、pPICZαA、毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）宿主菌X-33购自Invitrogen公司。大肠杆菌K88、K99、987P和K12D31、金黄色葡萄球菌CowanI、猪沙门氏菌C782购自中国兽药监察所。凝胶DNA纯化试剂盒Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、高保真的DNA聚合酶PrimeSTAR®HSDNA Polymerase、T4 DNA连接酶和各种限制性核酸内切酶均购自Takara公司。低分子量蛋白质标准购自Sigma-aldrich公司（M3546）。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 抗菌肽的设计与基因合成

以抗菌肽Cecropin A和Magainin的氨基酸序列为基础，通过蛋白结构分析工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa＿automat.pl？page＝npsa＿sopma.html）、蛋白理化特性分析工具（http：//www.expasy.org/）和抗菌肽数据库APD的在线预测和设计工具（http：//aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction＿main.php）对所设计抗菌肽的抗菌活性进行预测，设计了一种新型抗菌肽CAMa，选用酵母偏爱密码子设计抗菌肽CAMa基因，在其N端加上α信号肽Kex2裂解位点，并分别在两端引入XhoI和XbaI酶切位点。基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 宿主转移载体的构建与鉴定

分别用XhoI和XbaI将抗菌肽基因片段和宿主转移载体pPICZαA酶切，回收目的片段，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布于Zeocin＋的LB固体培养基平板上，37℃培养16—24 h。挑单菌落，用特异引物 CAMa1（5-CCTCTCGAGAAAAGAAAGTGGAAGC-3）和 CAMa2（5-CGCTCTAGATCAGAACTTCTTCTTACTGTGC-3）进行菌落PCR鉴定，阳性菌株送大连Takara公司测序，最终获得含有目的片段的重组载体pPICZαA-CAMa。

1.4 酵母菌株的电转化与重组菌的鉴定

将SacI单酶切线性化的质粒 pPICZαA-CAMa，加入酵母X-33感受态细胞悬液中，1.5 kV、25μF、200Ω电击转化，将转化物均匀涂布于含Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3—5 d。待YPDS平板上的阳性转化子生长到较大时，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1 000μg/mL的YPDS选择平板，在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落作为高拷贝重组菌株。提取筛选到的高拷贝重组菌株基因组DNA，利用鉴定引物CAMa1和pAOX2（5-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3）进行PCR鉴定。上游引物CAMa1位于插入片段抗菌肽基因区，下游引物AOX2位于毕赤酵母3’AOX基因区，引物由大连Takara公司合成。

1.5 重组酵母菌的诱导表达与鉴定

挑取筛选到的阳性重组菌单菌落，接种于含100μg/mL Zeocin的YPD培养液中，30℃、200 r/min培养18 h。取此菌液按1%体积比转接于20 mL BMGY培养基的250 mL锥形瓶中，30℃、200—220 r/min培养18—24 h，转接于100 mL BMMY培养基中，28℃、200 r/min继续培养72 h，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，进行Tricine-SDS-PAGE电泳和抑菌活性测定。

1.6 重组抗菌肽抗菌活性的初步测定

采用标准琼脂孔穴扩散法，以大肠杆菌K88、K99、987P、K12D31、金黄色葡萄球菌CowanI、猪沙门氏菌C782作为试验菌株，将处于对数生长期的供试菌悬浮液（稀释平板计数法测定：109个/mL）20μL与55℃的LB固体培养基20 mL混匀后铺板，待其凝固后，用灭菌直径5mm的打孔器打孔，孔中滴加50μL待测样品，37℃培养过夜，第2天观察抑菌圈，同时设100μg/mL氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）和链霉素（Streptomycin，S）为阳性对照。

1.7 抗菌肽溶血活性的测定

分别将重悬于PBS中的8%猪红细胞和鸡红细胞100μL加入96孔板中，再加入PBS系列稀释的抗菌肽100μL，使各孔中抗菌肽的质量体积浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL。阳性对照孔加入100μL 0.2%Triton X-100，阴性对照孔加100μL PBS，37℃孵育1 h后，3 000 r/min离心5 min，从各孔吸取100μL上清液到另一96孔板中，550 nm波长测定OD值，溶血比＝［（实验孔OD值-阴性孔OD值）/（阳性孔OD值-阴性孔OD值）］×100%。

1.8 抗菌肽替代抗生素在养猪生产中的应用试验

试验在上海某种猪场进行，仔猪为长白母猪与大约克种公猪杂交所产二元杂交种。挑选体重相近的25日龄刚断奶健康仔猪64头，随机分成2组，2个组的基础饲粮相同。抗生素对照组在基础饲粮中添加相应剂量饲用抗生素（0.12%的10%硫酸抗敌素预混剂），试验组在基础饲粮中添加相应剂量抗菌肽（0.4%抗菌肽）。试验所使用的10%硫酸抗敌素预混剂由浙江升华拜克生物股份有限公司生产，其中预混料不含其他任何抗菌促生长药物。饲料定量供应，自由饮水，常规方式管理，所有仔猪按正常的免疫程序接种疫苗。

在整个试验期间，观察试验猪群（试验组和对照组）仔猪的健康状况，包括皮肤、被毛和眼分泌物，并记录仔猪试验期间的死亡头数、腹泻发生情况、其他疾病的发生情况等指标；分别于25日龄断奶时、58日龄小保育后逐头称重，记录各组仔猪平均体重、平均增重、饲料消耗量及料重比。

1.9 数据处理

试验中所有数据用SPSS 10.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽CAM a的设计与基因合成

综合等电点、脂溶指数、二级结构、两亲性和抗菌活性分析预测，设计了一种新型抗菌肽CAMa。CAMa的GRAVY和Aliphatic index分别为-1.024和55.71。二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。疏水性氨基酸7个，亲水性氨基酸11个，疏水性和亲水性氨基酸也大体分别均匀分布在螺旋的两侧。蛋白结合势能为1.43 kcal/mol。

2.2 重组表达质粒pPICZαA-CAM a的构建与鉴定

PCR电泳结果显示所挑选的菌落均能扩增出约90 bp的DNA片段（图1），表明抗菌肽CAMa基因已经成功地连接到转移载体上。测序结果也表明目的片段已正确插入穿梭载体pPICZαA-CAMa中。

图1 重组载体中抗菌肽CAMa基因的PCR鉴定Fig.1 Identification of CAMa gene in recombinant vectors by PCR

2.3 抗菌肽CAM a重组酵母菌株的PCR鉴定

在高浓度Zeocin平板挑取两个pPICZαA-CAMa/X-33重组菌落，提取重组菌的基因组作模板，均扩增出254 bp的DNA片段。表明CAMa基因已经成功地整合到酵母菌X-33的基因组上（图2）。

图2 重组酵母转化子的PCR鉴定Fig.2 Identification of yeast genome DNA by PCR

2.4 阳性重组菌pPICZαA-CAM a/X-33的诱导表达

重组的pPICZαA-CAMa/X-33酵母菌经0.5%甲醇诱导培养72 h，培养上清液经初步分离纯化后进行Tricine-SDS-PAGE，扩增出一条约3.5 ku的特异性条带（图3）。

图3 SDS-PAGE电流分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis

2.5 重组抗菌肽CAM a抗菌活性的初步测定

由表1可知，新型抗菌肽CAMa对革兰氏阴性的大肠杆菌K88、K99、987P、K12D31菌株及革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌CowanI、猪沙门氏菌C782均有较好的抑杀活性。

表1 CAM a的抗菌活性Table 1 Antibacterial activity of CAM a mm

2.6 抗菌肽溶血活性测定结果

0.78—100μg/mL重组抗菌肽CAMa对猪红细胞和鸡红细胞均未表现出明显的溶血活性。

2.7 抗菌肽CAM a对断奶仔猪生产性能的影响

抗菌肽试验组猪较硫酸抗敌素对照组的增重、平均日增重分别提高了0.1 kg和2.76 g，抗菌肽CAMa稍优于硫酸抗敌素。而仔猪增重、平均日增生和料重比差异均不显著（P＞0.05），表明抗菌肽CAMa制剂对断乳仔猪的促生长效果与硫酸抗敌素的效果相当（表2）。

表2 抗菌肽CAM a对断乳仔猪生产性能的影响Table 2 Effect of CAM a on grow th performance of weaned piglets

2.8 抗菌肽CAM a对仔猪腹泻的影响

抗菌肽试验组与抗生素对照组相比，仔猪腹泻发生率降低，但两者腹泻发生率和平均腹泻天数差异均不显著（P＞0.05）。试验组的平均腹泻天数为2.0 d，较对照组的平均腹泻天数少0.71 d（表3），说明抗菌肽CAMa在仔猪断奶应激期间抗应激腹泻效果较抗生素稍好。

表3 抗菌肽CAMa对断乳仔猪腹泻的影响Table 3 Effect of CAMa on diarrhea of weaned piglets

3 讨论

抗菌肽这类具有明显优势的新型抗菌药物已引起业界的重视，提高抗菌肽的活性和降低其毒性是当前研究开发的难点。随着对抗菌肽杀菌机理和构效关系的深入认识，研究者们开始尝试设计更广谱、杀菌能力更强的新型抗菌肽。抗菌肽分子的设计是基于抗菌肽结构与功能关系，通过一系列生物信息学方法［7-9］对天然抗菌肽进行定向改造或全新设计，来提高抗菌肽的活性并降低其毒性。目前，对两亲α-螺旋型的抗菌肽构效关系已经总结出一定的规律，即阳离子性和两亲性［10-11］。带正电荷的抗菌肽能区别机体细胞两性离子的细胞膜和带负电细菌的细胞膜，优先结合和杀死细菌；抗菌肽的两亲性决定其能有效融入细菌的细胞膜内，形成疏水通道。两亲性和疏水性对于抗菌活性非常重要，保持稳定的两亲结构及一定的疏水性才能进一步发挥抗菌肽的活性和选择性［12］，对比疏水性和α-螺旋的程度，两亲性显得更为重要［13-14］。

国内外研究者以天然抗菌肽为基础，通过截取肽链N端或C端部分序列，连接不同来源的抗菌肽片段，进而组成杂合肽等。Feng等［15］以牛乳铁蛋白肽和天蚕素B为基础设计了一种新的杂合抗菌肽LF15-CA8。Shin等［16］将cecropin A N端的8个残基作头，magainin 2 N端的12个残基作尾，合成得到杂合肽cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）。周霞等［17］将天蚕素A-蛙皮肽杂合肽基因抗菌肽的人工基因克隆到具有自切割功能的表达载体pTYB12上，并在大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中进行表达，表达产物对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌均有一定的抗菌活性。金丰良等［18］、许小霞等［19］、王秀青等［20］和冯惟萍等［21］根据天蚕素和马盖宁的氨基酸序列，分别设计了杂合肽 CA（1-8）-M（1-12）、（His）（6）-UBI-CA-MA、CA（1-7）-M（2-12）和W16-CA-MA。本试验以CecropinA和Magainin的氨基酸序列为基础，分别截取CecropinA和Magainin肽链部分序列，通过互联网和计算机软件，优化阳离子数和两亲性参数，设计了具有较好抗菌活性的抗菌肽分子CAMa，并在毕赤酵母中实现分泌表达，表达产物对一些临床分离的耐药致病菌株均有明显的抑制和杀灭作用，为其进一步的开发研究奠定了基础。

硫酸黏杆菌素（Colistinsulfatepremix）属抗生素类药，主要使敏感菌细胞膜通透性增加，细胞内的重要成分外漏，从而导致细菌死亡。该类药主要用于猪、鸡、牛等，能显著刺激幼畜生长，提高饲料报酬，增加养殖效益，预防畜禽传染性胃肠炎，防治沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性细菌所引起的肠道病。在本试验中，与硫酸抗敌素相比，抗菌肽有提高增重、降低腹泻率的趋势，但差异不显著，抗菌肽CAMa完全可以代替抗生素用于预防断乳仔猪腹泻，是抗生素添加剂的理想替代品，具有广阔的推广应用前景。